雷海英 趙青松 楊瀟 王毛毛 白潔 孫永琪 王志軍

（1. 長治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系 長治 046011；2. 長治學(xué)院化學(xué)系 長治 046011）

植物根際是指植物根表面狹窄且靠近根的區(qū)域。它是土壤，根系和微生物相互作用的區(qū)域［1］。根際中植物根與有益微生物之間的相互作用是植物健康和土壤肥力的決定因素［2］。在植物的根際中存在促進(jìn)植物生長的有益細(xì)菌，稱為植物促生根際細(xì)菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）［3］。生物根際固氮微生物通過生命活動將大氣中的N2分子轉(zhuǎn)化為含氮化合物氨，并提供宿主植物生長所需的氮元素，以供植物吸收和利用，促進(jìn)植物生長［4］。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)的根際促生菌的促生機(jī)制逐漸被科學(xué)家闡明，包括固氮［5］、磷酸鹽增溶［6］、植物激素產(chǎn)生［7］、病原體抑制［8］、減輕壓力和乙烯控制［9-10］。如PGPR通過溶磷和生物固氮作用直接促進(jìn)生長，還可以通過活躍的土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)間接促進(jìn)植物生長。到目前為止，已經(jīng)從水稻［11］、小麥［12］、棉花［13］、玉米［14］等多種農(nóng)作物的根際分離出許多固氮細(xì)菌。這些固氮細(xì)菌屬于固氮菌屬（Azotobacter）、伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）、農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、無色桿菌屬（Achromobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、草螺菌屬（Spirospira）、克雷伯菌屬（Klebsiella）和沙雷氏菌屬（Serratia）等。而對藥用植物苦參的根際固氮菌的研究報道較少。

苦參（Sophora flavescensAit）為豆科槐屬多年生落葉亞灌木，又名苦槐、地槐、野槐、牛參等，全國各地均有分布，是中國傳統(tǒng)的藥用植物［15］?？鄥⒆鳛樗幱弥参锖卸喾N生物堿（苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿和氧化槐果堿等），在中國已有二千多年的歷史，其藥效始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，常以根入藥，具有清熱、燥濕，殺蟲、利尿的功效?？鄥⒑卸喾N化學(xué)成分，其有效成分苦參堿和氧化苦參堿具有良好的抗癌活性［16］。隨著苦參的開發(fā)利用及市場需求量的穩(wěn)步擴(kuò)大，苦參原料的需求也隨之增加。因此，苦參野生資源采挖趨勢有增無減，且優(yōu)質(zhì)苦參資源短缺，影響到臨床用藥的準(zhǔn)確性和中成藥療效的穩(wěn)定性，成為苦參產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約因素［17］。為推進(jìn)道地藥材基地建設(shè)，我國相關(guān)部門編制了《全國道地藥材生產(chǎn)基地建設(shè)規(guī)劃（2018-2025年）》，對促進(jìn)特色農(nóng)業(yè)發(fā)展和農(nóng)民持續(xù)增收、加快發(fā)展現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)、實(shí)現(xiàn)鄉(xiāng)村振興具有重要意義。

單一菌種普遍存在功能多樣性缺乏和抵抗負(fù)荷差等缺點(diǎn)，復(fù)合菌群菌種多樣性的特點(diǎn)使其能夠適應(yīng)各種生境，相互協(xié)調(diào)。本研究從三年生苦參根際土壤中分離、篩選了20株固氮細(xì)菌，選取促生、固氮能力較好的兩株固氮細(xì)菌，分為單菌株接種和復(fù)合菌株接種苦參幼苗，研究其對苦參幼苗的促生長能力，不僅為固氮菌在微生物復(fù)合菌肥中的研發(fā)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，而且在促進(jìn)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展，形成綠色有機(jī)的生態(tài)格局方面具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 供試土壤采自“山西省長治市振東道地藥材股份有限公司”三年生苦參種植基地根際土，共設(shè)5個采樣點(diǎn)，每個點(diǎn)隨機(jī)選取3株苦參，去掉地表枯枝落葉層，小心挖取苦參根，將根際土小心抖落在無菌小指管中帶回，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 阿須貝氏（Ashby）固氮菌培養(yǎng)基：甘 露 醇10.0 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.2 g，CaCO35.0 g，H2O定容至1 L。pH 7.0-7.2。

蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基配方：葡萄糖 10 g，（NH3）2SO40.5 g，酵母浸粉 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO40.03 g，卵磷脂 0.2 g，CaCO31.0 g，H2O定容至1 L。pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 苦參根際土壤固氮菌的篩選、鑒定 取5 g三年生苦參根際土壤加入到含30 mL吐溫80的無菌水中，振蕩20 min，靜置1 h，將其制成懸濁液，分別以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和 10-6梯度稀釋后，依次涂布于Ashby無氮培養(yǎng)基上，各稀釋梯度設(shè) 3個重復(fù)，置于 28℃下培養(yǎng) 3-4 d直至單菌落出現(xiàn)，進(jìn)行分離純化 3 次以上至獲得純培養(yǎng)，挑取單菌落至斜面培養(yǎng)基培養(yǎng) 2-3 d 后，4℃ 條件下保存，備用。

1.2.2 菌株鑒定 采用常規(guī)理化指標(biāo)檢測和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株的形態(tài)特征與生理生化進(jìn)行分析［18］。

采用細(xì)菌提取試劑盒（TaKaRa，大連）提取細(xì)菌DNA，對16S rRNA基因序列測定：瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量后，采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物對27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共 30 個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將擴(kuò)增得到的大小約為1 500 bp的條帶，連接到T-easy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性克隆質(zhì)粒后送至北京Invitrogen公司進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果，將得到的序列提交NCBI獲得序列號，同時登陸 EzTaxon server（http：//www. EzTaxon.org）進(jìn) 行序列比對，得出相似性較高的相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列，然后通過MEGA 5.0軟件進(jìn)行序列分析，用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），采用Kimura 2-parameter 作為模型，復(fù)制（Bootstrap replication）1 000 次，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ头€(wěn)定性，得到進(jìn)化樹。

1.2.3 產(chǎn) IAA 能力測定 利用Salkowki 比色法［19］對分離獲得的 20株 PGPR 菌株分泌 IAA 特性進(jìn)行測定參照，培養(yǎng)基中需加入色氨酸，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，以培養(yǎng)液為空白對照，測定波長 530 nm 處各培養(yǎng)液的吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的IAA濃度。

1.2.4 溶磷活性的測定 接種分離的固氮菌單菌落于 LB 液體培養(yǎng)基中，30℃ 180 r /min 培養(yǎng) 24 h，10 000 r /min 離心1 min 后去上清液，無菌水重懸菌體，取 1 mL接種于 50 mL 蒙金娜液體培養(yǎng)基中，同樣體積的對照接種在蒙金娜液體培養(yǎng)基，所有處理均設(shè) 3 個重復(fù)，同時于 30℃ 180 r /min 條件下培養(yǎng)1-7 d。從第 1 天開始，每天定時取上述菌懸液 4℃10 000 r /min 離心后 10 min，取上清，使用鉬銻抗比色法［20］，測定上清液中可溶性磷含量。待測菌株溶磷量即為可溶性磷含量的差值。

1.2.5 固氮酶活性測定 選取促生能力較好的8株菌株，采用乙炔還原法［21］測定固氮酶活性。將固體培養(yǎng)基中活化的菌株接種于LB培養(yǎng)基中，30℃恒溫條件下培養(yǎng)8 h。4℃下，5 000 r/min離心10 min后收集菌液，用0.85% 的生理鹽水洗滌3遍，用無氮培養(yǎng)基重懸至OD600=1.0。將2 mL菌種加入于20 mL頂空瓶中，頂空瓶中加入5 mL無氮培養(yǎng)基，用封口膜密封在30℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h，再用無菌頂空瓶蓋密封。用無菌注射器抽出2 mL氣體，再注入等體積乙炔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。抽取0.5 mL氣體進(jìn)入氣相色譜儀分析，測定樣品乙烯的峰面積及乙烯含量。每種菌株設(shè)3個重復(fù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)乙炔氣體的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到菌株的固氮能力。固氮酶活性（nmol /mg·h）計(jì)算公式如下。固氮酶活性 =（所測菌株乙烯峰面積×瓶子上方體積）/（1 nmoL 乙烯的峰面積×注入氣體體積×菌體蛋白含量×反應(yīng)時間）

1.2.6 菌株NF1-17和NF2-4的盆栽接種實(shí)驗(yàn) 選取菌株NF1-17和NF2-4，用接種環(huán)挑取少量菌體接種于含有50 mL LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。取上述菌液離心（4℃、6 000 r/min離心5 min），無菌水洗滌菌體3次，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至108CFU/mL制成菌劑。將菌劑NF1-17和NF2-4分單獨(dú)、復(fù)合（1∶1）接種，接入已萌發(fā)的苦參種子（種子在播種之前，先用濃硫酸處理軟化種皮）種于育苗基質(zhì)（腐熟花生皮∶蛭石∶珍珠巖∶雞蛋殼為50∶25∶20∶5）中，接種量為每盆2 mL，每個菌劑接種10盆，每盆種植3株苦參；置于溫室（25℃）培養(yǎng)，每個對照組則用等量無菌水代替，接種30 d后，對所獲取的根系樣本進(jìn)行分析，測定不同處理的總根長、根系表面積、平均根系直徑、根體積、根尖數(shù)、主根長等。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel和SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。采用Epson掃描儀獲取根系樣本，運(yùn)行WinRHIZO Pro根系分析系統(tǒng)軟件。

2 結(jié)果

2.1 根際固氮菌的分離

圖1 部分菌株的菌落形態(tài)（A-D）和顯微觀察結(jié)果（E-H）

從三年生苦參根際土壤中，共分離出20株固氮菌株。菌落形態(tài)如圖1所示，菌株NF1-4和菌株1-17為桿狀，菌株2-4和菌株3-24為球狀。

2.2 固氮菌的生理生化鑒定和IAA、溶磷能力

分離的20株菌株經(jīng)甲基紅試驗(yàn)、明膠液化和淀粉水解試驗(yàn)等（表1）。淀粉水解實(shí)驗(yàn)如圖2所示，菌株1-4和菌株1-17滴加碘液后淀粉被水解的地方會產(chǎn)生透明圈（圖2-B和2-C），為陽性反應(yīng)；NF2-4不能水解淀粉，在滴加碘液后會不產(chǎn)生透明圈（圖2-A），鑒定為陰性。對于20株菌株的產(chǎn)IAA分泌能力不同，分泌量在10-536 mg/L，其中分泌量較高的菌株NF2-15、NF3-28、NF3-18、NF2-4及NF1-17的能力分別為536 mg/L、515 mg/L、470 mg/L、451 mg/L和 286 mg/L；20株菌株的溶磷能力也不同，大小分別在0.390-1.908 mg/L，溶磷能力較大的菌株NF2-4、NF1-8、NF1-4、NF1-2、NF1-11的溶磷能力分別為1.908 mg/L、1.814 mg/L、1.448 mg/L、1.374 mg/L及1.340 mg/L。其中菌株NF1-17的溶磷能力為1.054 mg/L。

2.3 篩選菌株的16S rRNA基因序列分析

圖2 淀粉水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對20株菌株擴(kuò)增16S rRNA 基因的條帶，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其大小均在1.5 kb的單一條帶，經(jīng)克隆后測得的序列在NCBI與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，這些菌株在系統(tǒng)發(fā)育上分別分布于假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、劍菌屬（Ensifer）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）以及表皮葡萄球菌屬（Staphylococcus）等。其中有10株為假單胞菌屬和4株芽孢桿菌屬菌株。菌株NF1-17（MT140118）屬于假單胞菌屬Pseudomonas，與Pseudomonas R28的序相似性最高（99.93%）；菌株NF2-4（MT140119）屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），與Brevibacterium frigoritoleransDSM 8801的序列相似性最高（99.93%）（表2，圖3）。

2.4 固氮酶活性測定結(jié)果

從分離的20株菌株中，結(jié)合其產(chǎn)IAA與溶磷能力，選取8個菌株，每個菌株設(shè)3個重復(fù)，取平均值計(jì)算固氮酶活性，結(jié)果顯示8個菌株的固氮酶活性范圍為1.08-1.36 nmol/（g·h）（表3）。其中菌株NF2-19、菌株NF3-18、菌株NF2-4和菌株NF1-4的固氮酶活性分別為1.36 ± 0.17 nmol C2H4/（g·h）、1.33 ± 0.10 nmol C2H4/（g·h）、1.24 ± 0.22 nmol C2H4/（g·h）和1.24 ± 0.22 nmol C2H4/（g·h）。

表1 分離菌株生理生化指標(biāo)及促生能力

表2 16S rRNA基因序列比對結(jié)果

圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的20株苦參根際固氮菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 8個菌株的固氮酶活性測定

2.5 復(fù)合發(fā)酵菌劑NF1-17和NF2-4對苦參幼苗的接種結(jié)果

腐熟花生皮∶蛭石∶珍珠巖∶雞蛋殼為50∶25∶20∶5作為基本基質(zhì)，種入萌發(fā)的苦參種子，結(jié)合產(chǎn)IAA和溶磷能力，對菌株NF1-17和NF2-4進(jìn)行發(fā)酵，分別采用單一接種、混和接種的方式，每個菌劑接種10盆，每盆種植3株苦參，測定苦參幼苗的生長指標(biāo)。各項(xiàng)生長指標(biāo)結(jié)果如表4所示，接種不同處理菌劑30 d后的苦參幼苗，其長勢為：接種NF2-4和NF1-17復(fù)合菌劑 ＞ 單獨(dú)接種NF2-4菌劑 ＞ 單獨(dú)接種NF1-17菌劑 ＞ 接種無菌水（圖4）。接種NF1-17和NF2-4復(fù)合發(fā)酵菌劑的株高比單獨(dú)接種發(fā)酵菌劑NF1-17和NF2-4均表現(xiàn)出顯著的促生作用；接種復(fù)合菌劑的葉片數(shù)、總根體積、總根表面積、平均根系直徑都遠(yuǎn)超于其他單獨(dú)接種及未接種對照組，尤其根表面積、總根體積、平均直徑、根尖數(shù)、分枝數(shù)等，差異均顯著。所有植株生長形態(tài)指標(biāo)中，除莖粗外，添加NF1-17和NF2-4復(fù)合菌劑的苦參的所測指標(biāo)均最大；只接種無菌水的對照組指標(biāo)均明顯較低，同時由圖4所示，添加菌劑的苦參幼苗長勢明顯促進(jìn)苦參幼苗的生長，根系最發(fā)達(dá)，且復(fù)合發(fā)酵菌劑的形態(tài)指標(biāo)高于單獨(dú)添加菌劑的植株。

表4 兩菌株接種苦參幼苗的形態(tài)指標(biāo)

圖4 接種不同菌劑苦參幼苗及根系生長圖

3 討論

實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展已成為全球的戰(zhàn)略共識。目前，我國農(nóng)業(yè)過度依賴化肥、農(nóng)藥等化學(xué)物質(zhì)，化肥的平均施用量是發(fā)達(dá)國家化肥施用上限的2倍，農(nóng)藥用量是世界的3倍，已造成嚴(yán)重的土壤退化、沙化、水源污染和食品安全問題，這種不可持續(xù)的農(nóng)業(yè)發(fā)展模式亟需改變。微生物菌肥中應(yīng)用的根瘤菌、固氮菌、溶磷菌、促生菌和生防菌等PGPR是能夠在植物根際定殖，提高植物營養(yǎng)的可給性、抑制病原菌的生長或產(chǎn)生某些特殊的促生物質(zhì)，促進(jìn)植物種子萌發(fā)和植物生長、發(fā)育的一類細(xì)菌。研究表明，使用PGPR菌肥，能夠減少化肥用量20%-30%，減少農(nóng)藥用量30%以上，農(nóng)作物增產(chǎn)10%-80%，在發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)中的作用越來越受到重視，是實(shí)現(xiàn)化肥、農(nóng)藥雙減目標(biāo)的重要途徑［22］。土壤中不同屬的PGPR擁有不同的促生能力，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽胞桿菌屬（Bacillus）是促生能力較強(qiáng)的細(xì)菌類群［23］，它們的促生功能得到了廣泛關(guān)注和研究。

本研究中分離了20種固氮細(xì)菌，這些菌株在系統(tǒng)發(fā)育上分別分布于假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、劍菌屬（Ensifer）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）以及表皮葡萄球菌屬（Staphylococcus）等。其中有10株為假單胞菌屬和4株芽孢桿菌屬菌株。分離的假單胞菌屬占分離菌株的50%，是根際優(yōu)勢菌屬。假單胞菌是生防微生物的重要類群，也是自然界分布最廣的微生物之一，其繁殖快、定殖能力強(qiáng)、營養(yǎng)要求簡單，具有抑制多種植物病害和促進(jìn)植物生長的作用而被廣泛研究［24］。其次為芽孢桿菌屬，在土壤，水或與植物相關(guān)的土壤中的革蘭氏陽性，孢子形成，桿狀和兼性需氧細(xì)菌［25］，具有多種PGPR特性，例如固氮，磷酸鹽增溶，吲哚-3-乙酸生成和生物防治能力［26］。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生芽孢，存活時間長，能夠在多種土壤環(huán)境中生存，此外有些菌株能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，提高植物的抗逆性，進(jìn)而促進(jìn)植物生長和增強(qiáng)植物抗病害的能力，很多菌株被作為植物根際促生菌而廣泛研究，其在可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展中具有重要的現(xiàn)實(shí)意義［27-28］。

固氮菌能夠通過生物固氮等不同機(jī)制提高宿主的產(chǎn)量和改善宿主的品質(zhì)。篩選固氮能力比較強(qiáng)的菌株對于提高豆科植物的共生有效性，促進(jìn)豆科植物的生長有著重要的實(shí)際意義。本研究中分離的20株固氮菌中，菌株NF2-4（Bacillus）無論從分泌IAA、溶磷能力，還是固氮酶活性等方面，都表現(xiàn)出較高的水平，故作為研究促生菌的首選。并且從接種實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果看來，菌株NF2-4的促生作用極為明顯，較對照組表現(xiàn)出明顯的促生優(yōu)勢。然而，單一菌種普遍存在功能多樣性缺乏和抵抗負(fù)荷差等缺點(diǎn)，單一PGPR菌株的產(chǎn)品已很難完全滿足作物的需求。復(fù)合菌群菌種多樣性的特點(diǎn)使其能夠適應(yīng)各種生境，相互協(xié)調(diào)，在農(nóng)業(yè)上，復(fù)合菌群能提高土壤肥力，加速土壤養(yǎng)分的分解轉(zhuǎn)化，從而達(dá)到節(jié)約肥料，促進(jìn)植物根生長的功效；另外，有些復(fù)合菌群對雜草危害和病蟲害具有防治作用，同時能夠提高作物的抗病、抗寒、抗旱能力。因此，開發(fā)針對育苗的專用的復(fù)合菌群生物制品，對于促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)具有重要意義。因此綜合其分泌IAA能力和溶磷能力等指標(biāo)，同時選擇菌株NF1-17（Pseudomonas）作為復(fù)合菌肥的研究對象。

株高和莖粗是評價植物幼苗生長速度和壯碩程度的重要形態(tài)指標(biāo)，而根系是植物的兩大工廠（葉和根）之一，它擔(dān)負(fù)著艱巨而繁重的工作，具有吸收水分和無機(jī)鹽，進(jìn)行新陳代謝，固定植物等作用。發(fā)育良好的根系，側(cè)根較多，根體積較大，吸收面積較大，吸收能力也越強(qiáng)，尤其對于藥用部位是根部的藥用植物，根的發(fā)育更為重要?？鄥⒏瞪L發(fā)達(dá)與否關(guān)系到苦參作為藥材的產(chǎn)量及質(zhì)量，苦參根系的壯碩程度可以作為接種劑促生效率的評價指標(biāo)。本研究中，接種NF1-17和NF2-4菌株在溫室的基質(zhì)中顯著促進(jìn)了苦參幼苗的生長，表現(xiàn)出較強(qiáng)的促生效果，尤其接種復(fù)合菌株的苦參幼苗，其株高、葉片數(shù)、主根長、總根表面積、總根體積、平均根直徑、根尖數(shù)和分枝數(shù)等，與對照及單菌接種相比，都表現(xiàn)出顯著的促生優(yōu)勢。

4 結(jié)論

共分離了苦參根際高效固氮菌20株，其中芽孢桿菌NF2-4表現(xiàn)出良好的促生能力，為進(jìn)一步研究復(fù)合微生物菌肥的促生優(yōu)勢，添加固氮菌株假單胞菌NF1-17，對苦參盆栽苗接種，結(jié)果復(fù)合發(fā)酵菌株表現(xiàn)出良好的促生效果，為今后PGPR菌株的在復(fù)合微生物菌肥中的推廣應(yīng)用提供可行性。