潘沫晗 陸添權(quán) 田波
(1. 中國科學院西雙版納熱帶植物園 熱帶植物資源可持續(xù)利用重點實驗室,昆明 650223;2. 中國科學院大學,北京101408)
滇牡丹(Paeonia delavayi)屬芍藥科芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.MoutanDC.)植物,是中國西南地區(qū)特有的野生資源植物,是芍藥屬分布最南的一個牡丹類群[1]。作為一種民族藥材,其根皮入藥稱為丹皮,用于鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、退熱、止血、降糖,具有很好的藥用價值[2]。同時滇牡丹是油用牡丹新品種培育的重要種質(zhì)資源,也是開發(fā)食用油的潛在木本油料植物資源之一。牡丹籽油作為一種多功能食用油,含有至少14種脂肪酸成分,包括油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸等,其中亞麻酸的含量極高[3],油脂品質(zhì)優(yōu)良,營養(yǎng)豐富。目前,關于滇牡丹的研究主要集中在栽培學[4]、孢粉學[5]、病害防治[6]及遺傳多樣性[7-8]方面,關于滇牡丹的分子生物學研究的報道較少。目前將分子生物學技術應用于植物基因功能的研究較為普遍,而研究植物生長發(fā)育過程中關鍵基因的功能是開發(fā)利用這些基因的前提。功能基因表達量及表達模式是確定基因功能的重要指標,內(nèi)參基因是檢測基因表達量的必要參照,在檢測目標基因表達水平變化中起到校正作用,篩選合適的內(nèi)參基因是研究基因表達的關鍵,能夠減少實驗誤差,提高結(jié)果可靠性[9]。因此,篩選相對穩(wěn)定的內(nèi)參是研究基因表達分析的前提[10]。
實時熒光定量PCR技術具有準確性強、操作簡單、結(jié)果可靠且成本低廉的特點。目前已經(jīng)被廣泛應用于分子生物學研究的多個領域。聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)自從被發(fā)現(xiàn)后[11],就迅速成為科學研究的熱點,并被進一步應用于醫(yī)學研究。目前在植物學研究中的應用也越來越廣泛,常見于植物抗逆機理研究、病原菌的檢測、植物與微生物互作機理研究、植物抗病性檢測、信號轉(zhuǎn)導、環(huán)境對植物基因表達的影響等方面[12],解決了許多植物病理學和植物育種中的熱點和焦點問題。大量文獻表明熒光定量PCR技術已應用于主要作物如缺素條件的水稻[13],轉(zhuǎn)基因的玉米[14]、大豆[15]等,近年來在林木如杉木[16]和黃梁木[17]甚至中藥中如川續(xù)斷[18]、黃精[19]和穿心蓮[20]也都采用了實時熒光定量PCR技術展開相關研究。
在植物的熒光定量PCR實驗中,常用的內(nèi)參基因主要包括肌動蛋白基因(ACT)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因(EF1α)及β微管蛋白基因(TUB)等,這些常用的內(nèi)參基因或參與細胞的基本代謝,或是作為細胞的組成成分,根據(jù)實驗條件和材料的特點選擇相應合適的內(nèi)參進行標準化是得到準確熒光定量分析結(jié)果的關鍵[21]?;诘崮档しN子發(fā)育過程中的基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并參考相關文獻,本研究選擇了8個看家基因(Housekeeping genes,HKGs)即GAPC、PEPC、CYC、ACT、EF2α、TUB、ACP1和RPL1作 為 候 選內(nèi)參基因,選擇Ge Norm等3個程序評估了8個候選內(nèi)參基因在滇牡丹不同發(fā)育時期的種子中熒光定量PCR檢測結(jié)果的穩(wěn)定性,為檢測滇牡丹不同發(fā)育時期種子中功能基因的表達分析提供參考。
采集于云南省玉溪市澄江縣梁王山(東經(jīng)102°52'45",北緯24°43'57")野生分布的滇牡丹種子,牡丹開花后每隔15 d取一次樣,分別取開花后25、40、55、70和85 d的種子。將所取的滇牡丹種子樣品置于冷凍管中,放于液氮中速凍,凍存后備用。
1.2.1 RNA的提取 不同發(fā)育時期的滇牡丹種子樣品RNA提取采用TIANGEN公司的多糖多酚總RNA提取試劑盒(DP441),按照說明書進行操作。獲得樣品總RNA。
1.2.2 總RNA的檢測 獲得總RNA后,用1%的瓊脂糖電泳和紫外分光光度計檢測RNA樣品質(zhì)量。測定總RNA的濃度和純度,A260/280≈2.0-2.1,A260/230≈2.0,電泳檢測結(jié)果顯示總RNA完整性較好,條帶清晰,無DNA和其他雜質(zhì)污染,28S與18S條帶比值約為2∶1,適合用作進一步反應。然后將提取的RNA樣品置于-80℃儲藏備用。
1.2.3 反轉(zhuǎn)錄cDNA 樣品反轉(zhuǎn)錄采用TIANGEN公司的FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(KR118)試劑盒按說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反應體 系 如 下:總 反 應 體 系20 μL,5×FastKing-RT SuperMix 4 μL,總RNA 1 μg,加RNA-free純水補足到20 μL。反應程序為42℃、15 min:95℃、3 min。反應的第一步為去除基因組并進行反轉(zhuǎn)錄反應,第二步進行了酶滅活,完成cDNA第一鏈的合成。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即cDNA置于-20℃下保存,以備進行后續(xù)PCR反應。
1.2.4 內(nèi)參基因的選擇和引物設計 根據(jù)滇牡丹種子全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(未發(fā)表)選擇了GAPC、PEPC、CYC、ACT、EF2α、TUB、ACP1和RPL1共8個候選基因作為滇牡丹種子不同發(fā)育時期的內(nèi)參基因。利用Primer Premier 5.0軟件進行特異性引物的設計,標準如下:引物Tm 55±5℃,堿基長度18-22 bp,GC含量介于40%-60%之間。擴增產(chǎn)物長度在200-300 bp之間。由擎科生物科技有限公司(昆明)負責合成,引物信息見表1、2。對設計的引物進行PCR擴增,通過凝膠電泳驗證其特異性。
表1 候選基因的名稱
表2 八個候選內(nèi)參基因的引物序列
1.2.5 熒光定量PCR 本實驗采用QIAGEN 公司的QuantiNova SYBR Green PCR Kit試劑盒,在384孔板的LightCycler 384 System上進行點樣,在羅氏LightCycler480 II 實時熒光定量PCR儀器上設置參數(shù),進行熒光定量PCR反應,每個樣品設置3個重復。反應體系為:總體系10 μL。包含上下游引物各1 μL,1 μL cDNA模板,5 μL 2× SYBR Green PCR Master Mix,1 μL QN ROX Reference Dye,1 μL RNase-free water。反應條件:預變性95℃、2 min;變性95℃、5 s;退火60℃、10 s,共40個循環(huán)。延伸階段收集熒光信號,反應結(jié)束后獲得溶解曲線。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析 一般認為擴增效率E應介于90%-110%之間。采用GeNorm等3個軟件對候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行分析。首先計算ΔCt,根據(jù)公式E=2-ΔCt,將數(shù)據(jù)輸入Excel表格,導入分析軟件進行分析,獲得候選內(nèi)參基因的表達值,判定出穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因。
選擇開花后25、40、55、70、85 d的種子,利用TIANGEN公司的多糖多酚總RNA提取試劑盒(DP441)方法提取上述樣本的總RNA,并對獲得的RNA 的濃度和質(zhì)量進行檢測,獲得的RNA條帶(圖1),質(zhì)量完好可用做下一步反應。
圖1 滇牡丹總 RNA 樣品的電泳檢測結(jié)果
為了保證熒光定量分析的準確性,本實驗用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和測序?qū)?個候選內(nèi)參基因的引物特異性進行驗證,結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物段大小符合預計(圖2),無引物二聚體和非特異擴增片段。
圖2 滇牡丹8個候選內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果
基因的表達豐度用Ct表示,對各基因的表達豐度進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(圖3),在滇牡丹種子不同發(fā)育時期,8個內(nèi)參基因的表達水平存在一定變化,其中TUB基因的表達豐度相對較高,而CYC和EF2α內(nèi)參基因的表達豐度較低。
圖3 八個內(nèi)參基因在滇牡丹種子不同發(fā)育時期的Ct值變化
為了篩選在種子不同發(fā)育時期均能穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因,本實驗利用 GeNorm 和 Normfinder和BestKeeper軟件分別對開花后 25、40、55、70和85 d 的種子中的 8 個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行了分析。
2.3.1 GeNorm 分析結(jié)果 GeNorm軟件用M 值評估各表達穩(wěn)定性,分析結(jié)果顯示,8個候選內(nèi)參基因在種子不同發(fā)育時期中M值有所差異,根據(jù)表達穩(wěn)定性大小排序(M 值越小越穩(wěn)定),由高到低依次為CYC/EF2(0.824)>RPL1(1.087)>PEPC(1.296)>GAPC(1.545)>TUB(1.625)>ACP(1.801)>ACT(1.958)(圖4)。
圖4 GeNorm 軟件分析滇牡丹種子不同發(fā)育時期內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值排序
GeNorm 軟件生成內(nèi)參基因的配對變異數(shù)(Vn/n+1)柱形圖,可以根據(jù)柱形圖選擇的最適合內(nèi)參基因數(shù)目。GeNorm軟件可以通過分析計算所得的配對差異值Vn/n+1來確定該實驗條件下所需內(nèi)參基因的最適個數(shù),以減少使用單一內(nèi)參基因所引起的偏差和波動。選擇閾值為0.15,當Vn/n+1>0.15,表明最適合的內(nèi)參基因個數(shù)是n+1個;Vn/n+1<0.15,表明最適合的內(nèi)參基因有n 個。GeNorm柱形圖分析結(jié)果顯示當選擇 V2/3值(0.383)大于程序所推薦值 0.15(圖 5),最合適的內(nèi)參組合基因數(shù)目是 3個。滇牡丹種子不同發(fā)育時期表達最穩(wěn)定的基因組合是RPL1,EF2和CYC,最不穩(wěn)定的基因是ACT。
圖5 GeNorm軟件分析確定滇牡丹種子不同發(fā)育時期的最適內(nèi)參基因的數(shù)目
2.3.2 NormFinder 分析結(jié)果 Normfinder 是基于方差分析對內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性直接進行評價,通CYC和EF2α作為內(nèi)參基因, 選擇滇牡丹種子中油脂合成途經(jīng)相關基因(表5),設計引物(表6),對其表達量進行RT-qPCR分析,結(jié)果表明,以不同基因作為內(nèi)參,5個油脂合成途徑相關基因在RTqPCR分析中的表達趨勢基本一致,相對表達量結(jié)果相近(圖6)。
表5 關鍵基因的名稱
目前,應用最為廣泛的基因表達分析手段是熒光定量PCR技術,但是 RNA 不完整、污染以及反轉(zhuǎn)錄效率低等因素常影響其準確性。因此,選用合適的內(nèi)參基因是保證熒光定量PCR分析結(jié)果可靠性過程序計算獲得穩(wěn)定值(Stability,S),穩(wěn)定值越低代表基因的表達穩(wěn)定性越高,但該軟件只能選擇一個合適的內(nèi)參基因作標準。分析結(jié)果顯示,TUB內(nèi)參基因最穩(wěn)定,而ACT基因最不穩(wěn)定(表 3)。該軟件的結(jié)果與 GeNorm得出的結(jié)果相比稍有不同,這可能與2種軟件的計算方法的差異有關。但關于ACT基因在8個基因中表達最不穩(wěn)定的結(jié)果。兩個軟件的結(jié)果是一致的。
表3 NormFinder 軟件分析滇牡丹不同發(fā)育時期種子內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性
2.3.3 BestKeeper分析結(jié)果 BestKeeper軟件主要通過該程序計算可以獲得標準變異系數(shù)(SD)和變異相關系數(shù)(CV)以及每個基因之間產(chǎn)生配對的相關系數(shù)(r),以這3個參數(shù)來判斷內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。判定原則為相關系數(shù)越大、標準偏差和變異系數(shù)越小,內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好,反之,穩(wěn)定性越差;其中 SD 值的默認閾值為 1.0,低于該值即認為表達穩(wěn)定;當 SD>1 時,則該內(nèi)參基因表達不穩(wěn)定。BestKeeper分析結(jié)果(表4)顯示只有CYC、EF2α基因的SD值小于1,根據(jù)r值排序,EF2α>CYC,綜合結(jié)果發(fā)現(xiàn)EF2α和CYC基因表達最穩(wěn)定,而ACT基因在8個內(nèi)參基因中表達穩(wěn)定性最差。2.4 候選目標基因RT-qPCR分析
以通過穩(wěn)定性綜合評價得到的表現(xiàn)最穩(wěn)定的的重要前提[22]。為挖掘適用于滇牡丹種子不同發(fā)育時期基因表達分析的內(nèi)參基因,本研究以滇牡丹不同發(fā)育階段的種子為材料,選擇8個候選內(nèi)參基因,利用 Genorm、Normfinder和BestKeeper 軟件分析了它們在滇牡丹成種子不同發(fā)育時期的表達穩(wěn)定性。根據(jù)各軟件評價標準[23-25],綜合3個軟件分析的結(jié)果,成功篩選出了符合要求的內(nèi)參基因。3個軟件分析的結(jié)果表明,在種子的不同發(fā)育時期中能夠穩(wěn)定表達的基因是CYC基因和EF2α基因,3個軟件分析結(jié)果都顯示ACT基因的穩(wěn)定性較差,說明該基因不適合作為滇牡丹種子的內(nèi)參基因。
表4 BestKeeper 軟件分析滇牡丹不同發(fā)育時期種子內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性
表6 五個關鍵基因的引物序列
圖6 滇牡丹種子中油脂合成相關基因的熒光定量PCR分析結(jié)果(分別以CYC和EF2α為參照)
肌動蛋白ACT基因是植物中被廣泛應用的內(nèi)參基因。在“金魁”獼猴桃(Actinidia deliciosa)中表達最為穩(wěn)定[26],在不同發(fā)育時期的銀杏(Ginkgo biloba)雌株葉片中也是表達最穩(wěn)定[27],該結(jié)論同樣也在4種木本油料種子油茶(Camellia oleifera)、沙棘(Hippophae rhamnoides)、文冠果(Xanthoceras sorbifolia)和油用牡丹(Paeonia suffruticosa)中得到了驗證[28],而在本實驗中ACT基因的表達極不穩(wěn)定,這進一步驗證了同一內(nèi)參基因在不同實驗材料中表達穩(wěn)定性不一定相同的結(jié)論。
CYC基因(親環(huán)素),又稱環(huán)孢素A結(jié)合蛋白,也寫作CYP等,具有多種生物學活性,存在于細胞質(zhì)和各個細胞器內(nèi)。CYC基因在甜櫻桃的營養(yǎng)器官中是最適宜的內(nèi)參基因[28],在大豆種子發(fā)育過程中也是表達最穩(wěn)定的[15],這都與本研究的結(jié)果一致。而EF2α基因(Translation elongation factor 2),即翻譯延伸因子2,也寫作EF2,是編碼蛋白質(zhì)合成過程中一類蛋白質(zhì)因子的基因。因為表達量恒定,所以是熒光定量PCR中常用的內(nèi)參基因之一。之前有關于蘿卜的研究發(fā)現(xiàn),在不同品種、組織類型、光周期和春化處理及不同發(fā)育階段驗證8個候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性時,EF2在不同的實驗條件下均能穩(wěn)定表達[29]。本實驗中,EF2同樣在滇牡丹種子的不同發(fā)育時期穩(wěn)定表達。
已有研究報道了牡丹組中不同物種基因表達分析的最適內(nèi)參基因,王彥杰等[30]以牡丹(Paeonia suffruticosaAndr.)的不同組織(根、莖、葉和花瓣)為材料,利用熒光定量 PCR技術探討了5種常用看家基因的表達情況,認為各實驗條件下使用UBQ和GAPDH兩個表達最穩(wěn)定的基因組合。評估牡丹的10個內(nèi)參基因發(fā)現(xiàn)GAPDH和UBC被認為是在“鳳丹”(Paeonia ostii)和“西施”(Paeonia ostii)品種中最穩(wěn)定的兩個參考基因[31]。張莞晨等[27]研究油用牡丹(Paeonia suffruticosa)種子的7個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)表達最穩(wěn)定的基因是ACT。這些與本實驗獲得的結(jié)果有很大的差異,有可能是因為實驗所用的材料不同,說明滇牡丹與油用牡丹雖然同屬于芍藥屬植物,但二者之間存在一定的差異性。本研究以篩選到的表現(xiàn)最穩(wěn)定的CYC和EF2α基因作為內(nèi)參,對滇牡丹轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中篩選到的油脂合成途徑中的部分相關基因表達量進行熒光定量PCR驗證,發(fā)現(xiàn)5個油脂合成相關的基因的熒光定量PCR結(jié)果的表達趨勢基本一致,表達量相近,表明本研究篩選出的內(nèi)參基因可用作滇牡丹之間油脂合成相關基因表達分析的內(nèi)參基因,也為牡丹組其他植物油脂合成相關基因表達量分析時內(nèi)參基因的篩選提供了參考。
本實驗通過3個軟件評估了8個傳統(tǒng)內(nèi)參基因在滇牡丹種子中表達的穩(wěn)定性,獲得了兩個最適合滇牡丹種子的內(nèi)參基因CYC和EF2。