潘沫晗 陸添權(quán) 田波

（1. 中國科學院西雙版納熱帶植物園 熱帶植物資源可持續(xù)利用重點實驗室，昆明 650223；2. 中國科學院大學，北京101408）

滇牡丹（Paeonia delavayi）屬芍藥科芍藥屬（Paeonia）牡丹組（Sect.MoutanDC.）植物，是中國西南地區(qū)特有的野生資源植物，是芍藥屬分布最南的一個牡丹類群［1］。作為一種民族藥材，其根皮入藥稱為丹皮，用于鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、退熱、止血、降糖，具有很好的藥用價值［2］。同時滇牡丹是油用牡丹新品種培育的重要種質(zhì)資源，也是開發(fā)食用油的潛在木本油料植物資源之一。牡丹籽油作為一種多功能食用油，含有至少14種脂肪酸成分，包括油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸等，其中亞麻酸的含量極高［3］，油脂品質(zhì)優(yōu)良，營養(yǎng)豐富。目前，關于滇牡丹的研究主要集中在栽培學［4］、孢粉學［5］、病害防治［6］及遺傳多樣性［7-8］方面，關于滇牡丹的分子生物學研究的報道較少。目前將分子生物學技術應用于植物基因功能的研究較為普遍，而研究植物生長發(fā)育過程中關鍵基因的功能是開發(fā)利用這些基因的前提。功能基因表達量及表達模式是確定基因功能的重要指標，內(nèi)參基因是檢測基因表達量的必要參照，在檢測目標基因表達水平變化中起到校正作用，篩選合適的內(nèi)參基因是研究基因表達的關鍵，能夠減少實驗誤差，提高結(jié)果可靠性［9］。因此，篩選相對穩(wěn)定的內(nèi)參是研究基因表達分析的前提［10］。

實時熒光定量PCR技術具有準確性強、操作簡單、結(jié)果可靠且成本低廉的特點。目前已經(jīng)被廣泛應用于分子生物學研究的多個領域。聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）自從被發(fā)現(xiàn)后［11］，就迅速成為科學研究的熱點，并被進一步應用于醫(yī)學研究。目前在植物學研究中的應用也越來越廣泛，常見于植物抗逆機理研究、病原菌的檢測、植物與微生物互作機理研究、植物抗病性檢測、信號轉(zhuǎn)導、環(huán)境對植物基因表達的影響等方面［12］，解決了許多植物病理學和植物育種中的熱點和焦點問題。大量文獻表明熒光定量PCR技術已應用于主要作物如缺素條件的水稻［13］，轉(zhuǎn)基因的玉米［14］、大豆［15］等，近年來在林木如杉木［16］和黃梁木［17］甚至中藥中如川續(xù)斷［18］、黃精［19］和穿心蓮［20］也都采用了實時熒光定量PCR技術展開相關研究。

在植物的熒光定量PCR實驗中，常用的內(nèi)參基因主要包括肌動蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（EF1α）及β微管蛋白基因（TUB）等，這些常用的內(nèi)參基因或參與細胞的基本代謝，或是作為細胞的組成成分，根據(jù)實驗條件和材料的特點選擇相應合適的內(nèi)參進行標準化是得到準確熒光定量分析結(jié)果的關鍵［21］?；诘崮档しN子發(fā)育過程中的基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并參考相關文獻，本研究選擇了8個看家基因（Housekeeping genes，HKGs）即GAPC、PEPC、CYC、ACT、EF2α、TUB、ACP1和RPL1作 為 候 選內(nèi)參基因，選擇Ge Norm等3個程序評估了8個候選內(nèi)參基因在滇牡丹不同發(fā)育時期的種子中熒光定量PCR檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，為檢測滇牡丹不同發(fā)育時期種子中功能基因的表達分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采集于云南省玉溪市澄江縣梁王山（東經(jīng)102°52'45"，北緯24°43'57"）野生分布的滇牡丹種子，牡丹開花后每隔15 d取一次樣，分別取開花后25、40、55、70和85 d的種子。將所取的滇牡丹種子樣品置于冷凍管中，放于液氮中速凍，凍存后備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 不同發(fā)育時期的滇牡丹種子樣品RNA提取采用TIANGEN公司的多糖多酚總RNA提取試劑盒（DP441），按照說明書進行操作。獲得樣品總RNA。

1.2.2 總RNA的檢測 獲得總RNA后，用1%的瓊脂糖電泳和紫外分光光度計檢測RNA樣品質(zhì)量。測定總RNA的濃度和純度，A260/280≈2.0-2.1，A260/230≈2.0，電泳檢測結(jié)果顯示總RNA完整性較好，條帶清晰，無DNA和其他雜質(zhì)污染，28S與18S條帶比值約為2∶1，適合用作進一步反應。然后將提取的RNA樣品置于-80℃儲藏備用。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄cDNA 樣品反轉(zhuǎn)錄采用TIANGEN公司的FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（KR118）試劑盒按說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反應體 系 如 下：總 反 應 體 系20 μL，5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，總RNA 1 μg，加RNA-free純水補足到20 μL。反應程序為42℃、15 min：95℃、3 min。反應的第一步為去除基因組并進行反轉(zhuǎn)錄反應，第二步進行了酶滅活，完成cDNA第一鏈的合成。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即cDNA置于-20℃下保存，以備進行后續(xù)PCR反應。

1.2.4 內(nèi)參基因的選擇和引物設計 根據(jù)滇牡丹種子全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（未發(fā)表）選擇了GAPC、PEPC、CYC、ACT、EF2α、TUB、ACP1和RPL1共8個候選基因作為滇牡丹種子不同發(fā)育時期的內(nèi)參基因。利用Primer Premier 5.0軟件進行特異性引物的設計，標準如下：引物Tm 55±5℃，堿基長度18-22 bp，GC含量介于40%-60%之間。擴增產(chǎn)物長度在200-300 bp之間。由擎科生物科技有限公司（昆明）負責合成，引物信息見表1、2。對設計的引物進行PCR擴增，通過凝膠電泳驗證其特異性。

表1 候選基因的名稱

表2 八個候選內(nèi)參基因的引物序列

1.2.5 熒光定量PCR 本實驗采用QIAGEN 公司的QuantiNova SYBR Green PCR Kit試劑盒，在384孔板的LightCycler 384 System上進行點樣，在羅氏LightCycler480 II 實時熒光定量PCR儀器上設置參數(shù)，進行熒光定量PCR反應，每個樣品設置3個重復。反應體系為：總體系10 μL。包含上下游引物各1 μL，1 μL cDNA模板，5 μL 2× SYBR Green PCR Master Mix，1 μL QN ROX Reference Dye，1 μL RNase-free water。反應條件：預變性95℃、2 min；變性95℃、5 s；退火60℃、10 s，共40個循環(huán)。延伸階段收集熒光信號，反應結(jié)束后獲得溶解曲線。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 一般認為擴增效率E應介于90%-110%之間。采用GeNorm等3個軟件對候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行分析。首先計算ΔCt，根據(jù)公式E=2-ΔCt，將數(shù)據(jù)輸入Excel表格，導入分析軟件進行分析，獲得候選內(nèi)參基因的表達值，判定出穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量檢測

選擇開花后25、40、55、70、85 d的種子，利用TIANGEN公司的多糖多酚總RNA提取試劑盒（DP441）方法提取上述樣本的總RNA，并對獲得的RNA 的濃度和質(zhì)量進行檢測，獲得的RNA條帶（圖1），質(zhì)量完好可用做下一步反應。

圖1 滇牡丹總 RNA 樣品的電泳檢測結(jié)果

2.2 內(nèi)參基因引物特異性驗證

為了保證熒光定量分析的準確性，本實驗用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和測序?qū)?個候選內(nèi)參基因的引物特異性進行驗證，結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物段大小符合預計（圖2），無引物二聚體和非特異擴增片段。

圖2 滇牡丹8個候選內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果

基因的表達豐度用Ct表示，對各基因的表達豐度進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)（圖3），在滇牡丹種子不同發(fā)育時期，8個內(nèi)參基因的表達水平存在一定變化，其中TUB基因的表達豐度相對較高，而CYC和EF2α內(nèi)參基因的表達豐度較低。

圖3 八個內(nèi)參基因在滇牡丹種子不同發(fā)育時期的Ct值變化

2.3 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

為了篩選在種子不同發(fā)育時期均能穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，本實驗利用 GeNorm 和 Normfinder和BestKeeper軟件分別對開花后 25、40、55、70和85 d 的種子中的 8 個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行了分析。

2.3.1 GeNorm 分析結(jié)果 GeNorm軟件用M 值評估各表達穩(wěn)定性，分析結(jié)果顯示，8個候選內(nèi)參基因在種子不同發(fā)育時期中M值有所差異，根據(jù)表達穩(wěn)定性大小排序（M 值越小越穩(wěn)定），由高到低依次為CYC/EF2（0.824）＞RPL1（1.087）＞PEPC（1.296）＞GAPC（1.545）＞TUB（1.625）＞ACP（1.801）＞ACT（1.958）（圖4）。

圖4 GeNorm 軟件分析滇牡丹種子不同發(fā)育時期內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值排序

GeNorm 軟件生成內(nèi)參基因的配對變異數(shù)（Vn/n+1）柱形圖，可以根據(jù)柱形圖選擇的最適合內(nèi)參基因數(shù)目。GeNorm軟件可以通過分析計算所得的配對差異值Vn/n+1來確定該實驗條件下所需內(nèi)參基因的最適個數(shù)，以減少使用單一內(nèi)參基因所引起的偏差和波動。選擇閾值為0.15，當Vn/n+1＞0.15，表明最適合的內(nèi)參基因個數(shù)是n+1個；Vn/n+1＜0.15，表明最適合的內(nèi)參基因有n 個。GeNorm柱形圖分析結(jié)果顯示當選擇 V2/3值（0.383）大于程序所推薦值 0.15（圖 5），最合適的內(nèi)參組合基因數(shù)目是 3個。滇牡丹種子不同發(fā)育時期表達最穩(wěn)定的基因組合是RPL1，EF2和CYC，最不穩(wěn)定的基因是ACT。

圖5 GeNorm軟件分析確定滇牡丹種子不同發(fā)育時期的最適內(nèi)參基因的數(shù)目

2.3.2 NormFinder 分析結(jié)果 Normfinder 是基于方差分析對內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性直接進行評價，通CYC和EF2α作為內(nèi)參基因， 選擇滇牡丹種子中油脂合成途經(jīng)相關基因(表5)，設計引物（表6），對其表達量進行RT-qPCR分析，結(jié)果表明，以不同基因作為內(nèi)參，5個油脂合成途徑相關基因在RTqPCR分析中的表達趨勢基本一致，相對表達量結(jié)果相近（圖6）。

表5 關鍵基因的名稱

3 討論

目前，應用最為廣泛的基因表達分析手段是熒光定量PCR技術，但是 RNA 不完整、污染以及反轉(zhuǎn)錄效率低等因素常影響其準確性。因此，選用合適的內(nèi)參基因是保證熒光定量PCR分析結(jié)果可靠性過程序計算獲得穩(wěn)定值（Stability，S），穩(wěn)定值越低代表基因的表達穩(wěn)定性越高，但該軟件只能選擇一個合適的內(nèi)參基因作標準。分析結(jié)果顯示，TUB內(nèi)參基因最穩(wěn)定，而ACT基因最不穩(wěn)定（表 3）。該軟件的結(jié)果與 GeNorm得出的結(jié)果相比稍有不同，這可能與2種軟件的計算方法的差異有關。但關于ACT基因在8個基因中表達最不穩(wěn)定的結(jié)果。兩個軟件的結(jié)果是一致的。

表3 NormFinder 軟件分析滇牡丹不同發(fā)育時期種子內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性

2.3.3 BestKeeper分析結(jié)果 BestKeeper軟件主要通過該程序計算可以獲得標準變異系數(shù)（SD）和變異相關系數(shù)（CV）以及每個基因之間產(chǎn)生配對的相關系數(shù)（r），以這3個參數(shù)來判斷內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。判定原則為相關系數(shù)越大、標準偏差和變異系數(shù)越小，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性越差；其中 SD 值的默認閾值為 1.0，低于該值即認為表達穩(wěn)定；當 SD＞1 時，則該內(nèi)參基因表達不穩(wěn)定。BestKeeper分析結(jié)果（表4）顯示只有CYC、EF2α基因的SD值小于1，根據(jù)r值排序，EF2α＞CYC，綜合結(jié)果發(fā)現(xiàn)EF2α和CYC基因表達最穩(wěn)定，而ACT基因在8個內(nèi)參基因中表達穩(wěn)定性最差。2.4 候選目標基因RT-qPCR分析

以通過穩(wěn)定性綜合評價得到的表現(xiàn)最穩(wěn)定的的重要前提［22］。為挖掘適用于滇牡丹種子不同發(fā)育時期基因表達分析的內(nèi)參基因，本研究以滇牡丹不同發(fā)育階段的種子為材料，選擇8個候選內(nèi)參基因，利用 Genorm、Normfinder和BestKeeper 軟件分析了它們在滇牡丹成種子不同發(fā)育時期的表達穩(wěn)定性。根據(jù)各軟件評價標準［23-25］，綜合3個軟件分析的結(jié)果，成功篩選出了符合要求的內(nèi)參基因。3個軟件分析的結(jié)果表明，在種子的不同發(fā)育時期中能夠穩(wěn)定表達的基因是CYC基因和EF2α基因，3個軟件分析結(jié)果都顯示ACT基因的穩(wěn)定性較差，說明該基因不適合作為滇牡丹種子的內(nèi)參基因。

表4 BestKeeper 軟件分析滇牡丹不同發(fā)育時期種子內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性

表6 五個關鍵基因的引物序列

圖6 滇牡丹種子中油脂合成相關基因的熒光定量PCR分析結(jié)果（分別以CYC和EF2α為參照）

肌動蛋白ACT基因是植物中被廣泛應用的內(nèi)參基因。在“金魁”獼猴桃（Actinidia deliciosa）中表達最為穩(wěn)定［26］，在不同發(fā)育時期的銀杏（Ginkgo biloba）雌株葉片中也是表達最穩(wěn)定［27］，該結(jié)論同樣也在4種木本油料種子油茶（Camellia oleifera）、沙棘（Hippophae rhamnoides）、文冠果（Xanthoceras sorbifolia）和油用牡丹（Paeonia suffruticosa）中得到了驗證［28］，而在本實驗中ACT基因的表達極不穩(wěn)定，這進一步驗證了同一內(nèi)參基因在不同實驗材料中表達穩(wěn)定性不一定相同的結(jié)論。

CYC基因（親環(huán)素），又稱環(huán)孢素A結(jié)合蛋白，也寫作CYP等，具有多種生物學活性，存在于細胞質(zhì)和各個細胞器內(nèi)。CYC基因在甜櫻桃的營養(yǎng)器官中是最適宜的內(nèi)參基因［28］，在大豆種子發(fā)育過程中也是表達最穩(wěn)定的［15］，這都與本研究的結(jié)果一致。而EF2α基因（Translation elongation factor 2），即翻譯延伸因子2，也寫作EF2，是編碼蛋白質(zhì)合成過程中一類蛋白質(zhì)因子的基因。因為表達量恒定，所以是熒光定量PCR中常用的內(nèi)參基因之一。之前有關于蘿卜的研究發(fā)現(xiàn)，在不同品種、組織類型、光周期和春化處理及不同發(fā)育階段驗證8個候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性時，EF2在不同的實驗條件下均能穩(wěn)定表達［29］。本實驗中，EF2同樣在滇牡丹種子的不同發(fā)育時期穩(wěn)定表達。

已有研究報道了牡丹組中不同物種基因表達分析的最適內(nèi)參基因，王彥杰等［30］以牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）的不同組織（根、莖、葉和花瓣）為材料，利用熒光定量 PCR技術探討了5種常用看家基因的表達情況，認為各實驗條件下使用UBQ和GAPDH兩個表達最穩(wěn)定的基因組合。評估牡丹的10個內(nèi)參基因發(fā)現(xiàn)GAPDH和UBC被認為是在“鳳丹”（Paeonia ostii）和“西施”（Paeonia ostii）品種中最穩(wěn)定的兩個參考基因［31］。張莞晨等［27］研究油用牡丹（Paeonia suffruticosa）種子的7個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)表達最穩(wěn)定的基因是ACT。這些與本實驗獲得的結(jié)果有很大的差異，有可能是因為實驗所用的材料不同，說明滇牡丹與油用牡丹雖然同屬于芍藥屬植物，但二者之間存在一定的差異性。本研究以篩選到的表現(xiàn)最穩(wěn)定的CYC和EF2α基因作為內(nèi)參，對滇牡丹轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中篩選到的油脂合成途徑中的部分相關基因表達量進行熒光定量PCR驗證，發(fā)現(xiàn)5個油脂合成相關的基因的熒光定量PCR結(jié)果的表達趨勢基本一致，表達量相近，表明本研究篩選出的內(nèi)參基因可用作滇牡丹之間油脂合成相關基因表達分析的內(nèi)參基因，也為牡丹組其他植物油脂合成相關基因表達量分析時內(nèi)參基因的篩選提供了參考。

4 結(jié)論

本實驗通過3個軟件評估了8個傳統(tǒng)內(nèi)參基因在滇牡丹種子中表達的穩(wěn)定性，獲得了兩個最適合滇牡丹種子的內(nèi)參基因CYC和EF2。