許來鵬 萬鮮花 孫向麗 曹艷芳李慧 田亞東 劉小軍 康相濤王彥彬

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，鄭州 450046；2. 河南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，鄭州 450046；3. 河南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，鄭州450002）

秸稈焚燒和化肥不合理使用，使土壤微生物豐度和多樣性降低，進而導致土壤酸化、板結(jié)、肥力下降等突出問題，不僅嚴重影響作物產(chǎn)量和糧食安全，而且對生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展和綠色環(huán)境造成不利影響［1-3］。減少化肥使用，進行有機替代，增施生物肥料是解決土壤問題，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的必然選擇［4-6］。生物肥料是指以微生物及其代謝產(chǎn)物為核心，使農(nóng)作物獲得特定肥料效應的一類生物制品。生物肥料不僅為農(nóng)作物提供豐富的碳、氮和礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素，更重要的是增加土壤中微生物的豐度和多樣性以及酶活性，有效分解有機質(zhì)，增強土壤肥力［7-8］；生物肥是以畜禽糞便或作物秸稈為基質(zhì)材料，經(jīng)腐熟發(fā)酵而成，由于原料不同其微生物組成存在差異。研究表明畜禽糞肥施用在玉米上能夠提高土壤生物活性，改善土壤理化性質(zhì)，增加產(chǎn)量［9-10］，但畜禽糞肥資源比較稀少，在玉米上很難承擔成本費用。秸稈還田是當前華北地區(qū)秸稈處理的主要措施，秸稈不經(jīng)腐熟發(fā)酵處理直接還田易受土壤微生物豐度、土壤溫度、pH值和含水量等條件的制約，影響到秸稈的腐解和利用［11-12］。另外，秸稈連續(xù)還田后增加了土壤中的有機質(zhì)，對土壤微生物多樣性結(jié)構(gòu)具有促進作用［13-14］，但其機制和效果需要深入研究。植物根際微生物類似于動物的腸道微生物，對植物的生長和健康發(fā)揮重要作用，植物從土壤中獲取各種營養(yǎng)物質(zhì)往往是通過微生物代謝實現(xiàn)的。本研究以玉米根際微生物為對象，研究秸稈連續(xù)還田對根際微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，探索秸稈還田替代畜禽糞肥的可行性。

根際微生物是指緊密附著于根際土壤顆粒中的微生物群，包括細菌和真菌，其中細菌占微生物總數(shù)的90%以上，它們作為一個復雜的生態(tài)體系，在調(diào)節(jié)陸地碳動態(tài)、養(yǎng)分循環(huán)和植物生產(chǎn)力方面發(fā)揮著關鍵作用。它們和植物間是互生關系，與植物根際相互作用、相互促進。在植物生長過程中，根際分泌的無機物和有機物為微生物提供了營養(yǎng)物質(zhì)或改變了土壤環(huán)境條件，從而調(diào)節(jié)根際微生物的生長和結(jié)構(gòu)組成［15-17］。微生物聚集在根際周圍，由呼吸作用放出二氧化碳或代謝產(chǎn)酸有助于難溶礦物質(zhì)的溶解，增加植物對磷及其他礦質(zhì)元素的吸收；微生物合成多種蛋白酶，把有機物降解轉(zhuǎn)化，為植物提供有效的養(yǎng)料［18］；同時，微生物還能產(chǎn)生氨基酸、維生素、抗生素、生長刺激素（如吲哚乙酸，赤霉素等）等，抑制病原菌的繁殖，促進植物生長［19］。根際微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要指標，與作物產(chǎn)量和品質(zhì)存在緊密相關性。因此，以根際微生物作為評價對象比單純以營養(yǎng)元素含量為標準評價生物有機肥更為科學。

玉米（Zea maysL.）是世界上種植范圍最廣泛、土地利用率最高的糧食作物之一，在我國黃淮海地區(qū)種植面積最廣。玉米相比小麥其生長期在夏季，氣溫高，土壤微生物繁殖旺盛，是研究根際微生物的適宜作物。近年來小麥和玉米秸稈連續(xù)還田已在華北地區(qū)廣泛推廣。研究表明秸稈連續(xù)還田能夠增加根際微生物豐度和多樣性［20］，抑制土壤病原菌［21］。但是秸稈連續(xù)還田對玉米根際微生物菌群組成和多樣性的影響與施用畜禽糞肥相比有何差異，該方面研究尚未見報道。本研究應用16S rDNA基因測序技術(shù)，研究秸稈連續(xù)還田對玉米根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，與施用畜禽糞肥相比較存在哪些差異，旨在為華北地區(qū)農(nóng)作物多種有機替代提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用種子為鄭原玉432玉米，由市場采購。

1.2 方法

1.2.1 試驗地點 試驗于河南農(nóng)業(yè)大學國家“2011計劃”現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗園區(qū)進行。試驗設計為二組，分別為秸稈連續(xù)還田組和禽糞有機肥施用組，面積為50 m×200 m。大壟雙行種植，壟上行距40 cm，壟間行距60 cm。

1.2.2 樣品分組與處理 秸稈還田組（Straw returning，SR）為小麥和玉米輪作，玉米秸稈翻耕時全量深埋還田，小麥秸稈粉碎全量覆蓋還田，連續(xù)3年。施用畜禽糞肥（Livestock and poultry manure，LM）區(qū)塊無秸稈還田，使用的畜禽糞肥是利用豬雞糞便為主要原料經(jīng)腐熟發(fā)酵而成。在小麥播種前土壤翻施畜禽糞肥100 kg/667 m2，在玉米播種后隨灌溉時再次撒施100 kg/667 m2，全年分二次共施用200 kg/667 m2。玉米生育期按照高產(chǎn)田進行田間管理。玉米成熟期隨機采樣，分別標記為秸稈還田組（A1-6和B1-6）和畜禽糞肥組（C1-6和D1-6），AC和BD分別由不同的人采樣。分別對兩組玉米穗粒數(shù)、單粒重、百粒重等產(chǎn)量性狀進行統(tǒng)計計算。

每個樣品，以莖根10 cm半徑范圍，挖取0-40 cm深的根系，輕輕抖動，去掉根系上脫落的土壤，剪取根系并保留緊密附著在根系上的土壤，置于裝有滅菌的0.86%NaCl溶液的50 mL離心管中，冰中放置30 min，每5 min搖勻一次，然后棄掉玉米根際，4 000 ×g、4℃離心30 min后倒掉上清液，所得的土壤沉淀物保存在無菌EP管中，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 土壤微生物DNA提取、PCR擴增及擴增產(chǎn)物的純化回收 應用土壤微生物DNA提取試劑盒（TIANGEN），按照使用說明提取樣品DNA，應用Nanodrop對DNA進行定量后，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。以細菌總DNA為模板，應用通用引物515F（5'-gtgccagcccgg-3'）和907R（5'-CC-GT-caattcmtragtt-3'）擴增16S rDNA的V4-V5區(qū)，擴增體系為25 μL。擴增產(chǎn)物磁珠純化回收并熒光定量。

1.2.4 制備測序文庫和上機高通量測序 采用Illumina公 司 的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit并按照說明制備測序文庫。上機測序前，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit對文庫進行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上對文庫進行檢測定量。根據(jù)操作說明使用Illumina MiSeq測序平臺對文庫進行雙端測序。本研究中測序所獲得的原始數(shù)據(jù)已存放在CNGBdb的CNSA（https：//db.cngb.org/CNSA/）中，注冊號為CNP0000832。

1.2.5 生物信息學分析 首先對高通量測序的原始下機數(shù)據(jù)根據(jù)序列質(zhì)量進行初步篩查；對問題樣本進行重測、補測。通過質(zhì)量初篩的原始序列按照index和Barcode信息，進行文庫和樣本劃分，并去除barcode序列。按照QIIME2 dada2分析流程進行序列去噪、OTUs聚類。根據(jù)ASV/OTU在不同樣本中的分布，評估每個樣本的Alpha多樣性水平，以Chao1指數(shù)反映豐富度，以Shannon和Simpson指數(shù)反映多樣性，以Pielou值反映均勻度。在ASV/OTU層面，計算各樣本的距離矩陣，并通過非約束排序，結(jié)合相應統(tǒng)計學檢驗方法，衡量不同樣本（組）間的beta多樣性差異及差異顯著性，并使用PICRUSt方法，基于16S rDNA序列對微生物群的功能潛能進行預測［22］。

1.2.6 統(tǒng)計分析 結(jié)果以“平均值±標準誤（means±SE）”表示。數(shù)據(jù)采用 SPSS 24.0 中獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 玉米穗部性狀統(tǒng)計結(jié)果

兩組玉米穗部性狀統(tǒng)計結(jié)果（表1）。SR組與LM組在粒數(shù)（粒）、總重（g）、總粒重（g）等產(chǎn)量相關的指標之間無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 玉米根際菌群的物種組成分析

利用高通量測序技術(shù)研究了不同處理方式的玉米根際菌群的多樣性。通過序列比對和注釋表明，在門水平上，兩組玉米根際菌群中的大多數(shù)歸屬于30多個門水平，圖1（前20門）顯示優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）和己科河菌門（Rokubacteria）等，在門水平上兩組的主要菌門構(gòu)成具有相似性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這兩組微生物群中變形菌門（Proteobacteria）的比例較高，且變形菌門（Proteobacteria）均為優(yōu)勢菌門，但在LM組，變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度顯著高于SR組（P＜0.01）。SR組中厚壁菌門（Firmicutes）和綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度顯著高于LM組（P＜0.01）。

表1 SR和LM兩組玉米的產(chǎn)量性狀

圖1 SR和LM兩組玉米的根際微生物在門分類水平的菌群組成

在屬水平，兩組玉米的根際微生物覆蓋了100多個類群。圖2（前20屬）顯示了這兩個類群的菌群結(jié)構(gòu)和相對豐度。優(yōu)勢菌屬主要包括芽胞桿菌屬（Bacillussp.）、根瘤菌屬（Rhizobium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、諾卡菌屬（Nocardioides）、壤霉菌屬（Agromyces）和Burkholderia等。在屬水平上兩組的主要菌屬構(gòu)成具有相似性。但芽孢桿菌屬在SR組中顯著高于LM組（P＜0.01），而壤霉菌屬（Agromyces）在LM組中顯著高于SR組。

2.3 玉米根際菌群Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是指特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)的多樣性。多樣性指數(shù)包括Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)，它們反映了樣品的豐富度、多樣性和均勻度等方面的指標。Chao1或ACE指數(shù)越大，群落的豐富度就越大。表2顯示SR組與LM組的Alpha 多樣性指數(shù)均無顯著差異（P＞0.05），說明兩組玉米的根際微生物群的多樣性和豐富度相似，具有較好的穩(wěn)定性。

2.4 玉米根際菌群Beta多樣性分析

圖2 SR和LM兩組玉米的根際微生物在屬分類水平的菌群組成

表2 SR和LM兩組玉米的根際微生物多樣性指數(shù)表

Beta多樣性指數(shù)聚焦于不同生態(tài)系統(tǒng)之間多樣性的比較，表示樣本間的差異。主坐標分析（Principal coordinates analysis，PCoA）便是一種最經(jīng)典的分析樣本間差異的分析方法。它通過將樣本距離矩陣經(jīng)過投影后，在低維度空間進行展開，并最大限度地保留原始樣本的距離關系。PCoA以樣本距離為整體考慮，相比于主成分分析（Principal analysis，PCA），更符合生態(tài)學數(shù)據(jù)特征，因此應用PCoA比較樣本間的差異。在主坐標分析圖中（圖3），兩組處理的玉米根際菌群組內(nèi)差異較小，群落組成更為相似，而組間比較表明兩組處理玉米根際菌群群落組成差異較大，表明玉米根際菌群結(jié)構(gòu)顯著受糞源微生物和有機質(zhì)差異的影響。

2.5 玉米根際菌群物種差異分析

圖3 SR和LM兩組玉米的根際微生物的PCoA結(jié)果

為了進一步比較樣本間的物種組成差異，實現(xiàn)對各樣本的物種豐度分布趨勢的展示，應用熱圖對SR和LM兩組玉米根際微生物群進行物種組成分析。平均豐度前50位的屬的豐度數(shù)據(jù)被繪制熱圖（圖4）。在對樣本聚類的圖中，樣本按照物種組成數(shù)據(jù)的歐式距離（Euclidean distance）進行UPGMA聚類，并根據(jù)聚類結(jié)果排列。在對物種聚類的圖中，按照其組成數(shù)據(jù)的Pearson 相關性系數(shù)矩陣進行UPGMA聚類，并根據(jù)聚類結(jié)果或者物種在樣本中的平均豐度排序。圖中，紅色色塊代表該屬在該樣本中的豐度較其他樣本高，藍色色塊代表該屬在該樣本中的豐度較其他樣本低。結(jié)果顯示A、B之間和C、D之間菌群的相對豐度無顯著差異（P＞0.05），表明不同人員采樣對結(jié)果的影響較小。但是SR組（A組+B組）和LM組（C組+D組）之間存在較大差異（P＜0.05），與Beta多樣性分析結(jié)果一致，表明受糞源微生物和有機質(zhì)差異的影響較為明顯。其中SR組的土壤單胞菌屬（Gemmatimonas）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、生絲微菌屬（Hyphomicrobium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等的相對豐度高于LM組，而LM組的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、土壤桿菌屬（Pedobacter）、壤霉菌屬（Agromyces）等的相對豐度顯著高于SR組（P＜0.05）。

圖4 SR和LM兩組根系微生物群的物種聚類在屬水平的組成熱圖

2.6 玉米根際菌群功能潛能預測

KEGG數(shù)據(jù)庫的核心為生物代謝通路分析數(shù)據(jù)庫（KEGG Pathway Database，（http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html），分 為6大 類，包括 代 謝（Metabolism）、遺 傳 信 息 處 理（Genetic Information Processing）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、細胞進程（Cellular Processes）、生物體系統(tǒng)（Organismal Systems）和人類疾?。℉uman Diseases）。在本研究中，兩組處理的玉米根際菌群的KEGG功能通路的豐度結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，SR組和LM組的玉米根際微生物共參與KEGG的 6大類功能通路，包括 45種子功能通路，且大多數(shù)富集于代謝通路，包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔酶和維生素的代謝、萜類化合物和聚酮類化合物代謝和異源物質(zhì)生物降解和代謝等。盡管在Beta多樣性分析中兩組菌群構(gòu)成存在顯著差異，但圖6顯示SR組與LM組主要功能基因分布無顯著差異，表明不同微生物在功能上可能存在互補性。

3 討論

圖5 SR和LM兩組玉米的根際微生物群的功能潛能預測

圖6 SR和LM兩組玉米的根際微生物群代謝功能基因分布

本研究應用16S rDNA高通量測序技術(shù)對玉米根際微生物菌群進行分析。結(jié)果顯示玉米根際微生物主要群落構(gòu)成在門水平和屬水平上兩組具有相似性，且兩組共有的OTUs達到7 849，獨有的OUTs分別為12 800（SR組）和11 297（LM組）。24個樣本共覆蓋30余個細菌類群，其中變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、綠彎菌門和棒狀桿菌是玉米根際中的優(yōu)勢菌門。在屬水平，優(yōu)勢菌屬主要包括芽胞桿菌屬、根瘤菌屬、黃桿菌屬、硝化螺旋菌屬、假單胞菌屬、諾卡菌屬、壤霉菌屬和Burkholderia等。在本研究中兩組均具有較高的微生物豐度，但玉米產(chǎn)量差異不顯著，此結(jié)果與Ma等［23］的報道相一致。楊志臣等［24］研究顯示直接施用作物秸稈同施用腐熟有機肥對土壤的培肥效果基本相同，均對土壤理化性質(zhì)有很大的改善，因此秸稈直接還田與施用畜禽糞肥具有同等的培肥土壤的效果。在本研究中，LM組的變形菌門的相對豐度要明顯高于SR組，但SR組中厚壁菌門的相對豐度要明顯高于LM組。在屬水平上，SR組的芽胞桿菌屬的相對豐度要明顯高于LM組，而壤霉菌屬的相對豐度低于LM組。糞源微生物組成和有機質(zhì)可利用碳源的差異可能是影響土壤細菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)差異的重要因素［25-26］。秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，芽胞桿菌能夠利用纖維素和半纖維素作為生長的碳源。而在豬、雞為主的畜禽糞肥中秸稈碳源含量相對較低，可能是芽胞桿菌屬在LM組中占比低于SR組的原因之一［27］。根際微生物與植物根系之間具有互作關系，根際微生物生長繁殖為植物生長提供了營養(yǎng)元素，同時植物根系也為微生物的生長提供了生存環(huán)境，間接選擇和促進了“適者生存”的根際微生物［28］。秸稈還田和畜禽糞肥兩種處理的玉米根際微生物主要菌群構(gòu)成具有相似性，這一結(jié)果是否與玉米品種相關尚需進一步研究［29］。

玉米根際微生物群落多樣性指數(shù)反映了玉米根際微生物群落結(jié)構(gòu)的復雜程度。通常來講，群落 Alpha 多 樣性指數(shù)（Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)）越高，表明微生物群落結(jié)構(gòu)越復雜，群落的穩(wěn)定性就越好。在本研究中，SR組與LM組的Alpha 多樣性指數(shù)無顯著差異，表明兩組玉米根際微生物群落均具有較高的豐富度、多樣性和穩(wěn)定性。兩組玉米根系微生物中包含許多益生菌如枯草芽胞桿菌、乳酸桿菌和解淀粉芽胞桿菌，這些微生物具有較強的益生功能，其不但能夠抑制植物病原菌，而且還能夠激發(fā)植物自身免疫力，從而增強植物的抗病性能［30-33］。菌群代謝功能預測的結(jié)果顯示SR組和LM組的玉米根際微生物參與代謝通路，主要包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔酶和維生素的代謝和萜類化合物和聚酮類化合物的代謝。盡管在門水平和屬水平上兩組中有部分菌群含量存在差異，但在功能預測分析上兩組的差異不明顯，表明不同微生物之間存在著功能多樣性，不同的玉米根系微生物通過相似的功能通路各自發(fā)揮著重要作用［34-35］。

4 結(jié)論

本研究利用高通量測序技術(shù)對不同處理方式的玉米根際微生物的多樣性進行測序分析，發(fā)現(xiàn)不同處理方式的玉米根際微生物的構(gòu)成和多樣性具有相似性，兩者的產(chǎn)量無顯著差異。表明秸稈連續(xù)還田與畜禽糞肥施用具有同樣的效果，都能提升玉米根際微生物豐度和多樣性。