徐洲 范晨龍 丁燏

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；3. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088）

溶藻弧菌是一種嗜鹽嗜溫性革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛生長(zhǎng)于海洋及出?？冢?-2］。它在pH為6-9，水溫為17-35℃時(shí)健康生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)鹽度與海水鹽度相差不多，所以在海水中常見［3］。它能使多種魚、蝦、貝表皮發(fā)生潰瘍、出血及黑斑等，在我國(guó)南方尤為嚴(yán)重［4］，在人身上表現(xiàn)為與傷口感染和胃腸道疾病相關(guān)，且常伴隨水樣腹瀉［5］，它不僅影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展，更危及人類的健康。

作用于肽鍵上的酶稱為肽酶，肽酶在生物體中與很多功能相關(guān)，如蛋白質(zhì)的消化、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的循環(huán)等［6］。PepA蛋白作為一種亮胺酰胺肽酶，在愛德華氏菌中PepA蛋白結(jié)合到esrB啟動(dòng)子區(qū)域并在早期負(fù)反饋調(diào)節(jié)T3/T6SSs表達(dá)的功能［7］，在大腸桿菌中PepA能破壞預(yù)先形成的封閉RNA聚合酶-DNA模板復(fù)合物，或抑制其在轉(zhuǎn)錄起始階段向下游階段的進(jìn)一步行動(dòng)，所以能抑制carAB操縱子的啟動(dòng)子P1的轉(zhuǎn)錄起始，即PepA蛋白就是轉(zhuǎn)錄阻遏物［8］，PepA蛋白負(fù)調(diào)控棘突的生物合成，其任何損害都可能影響棘孢菌的菌絲形態(tài)和生長(zhǎng)［9］。

乙?；瘜儆诘鞍仔揎椫卸喾N翻譯后修飾的一種，在枯草芽孢桿菌多細(xì)胞性中起著重要的調(diào)節(jié)［10］。乙酰化修飾既能提高某些蛋白的功能，也能阻遏某些蛋白的功能，如乙?；揎椷^后的黑穗醋栗果實(shí)多糖可以顯著提高多糖的自由基清除能力［11］，賴氨酸乙?；茏瓒粜∈缶又械倪^度蛋白［12］。但目前將乙?；揎椩诨【系难芯可僦稚?。由于溶藻弧菌的多重耐藥性很高［13］，所以需要新型治療方法。乙?；揎桮NAT蛋白后會(huì)影響水稻細(xì)菌性條斑病菌的毒力［14］，能調(diào)控PhoP蛋白的活性從而降低鼠傷寒沙門菌的毒力［15］，細(xì)菌RplB蛋白的乙?；瘯?huì)影響其核糖體蛋白的功能［16］，這些都說明乙?；揎棔?huì)直接或者間接影響細(xì)菌的毒力，這為我們研究乙酰化修飾對(duì)溶藻弧菌的毒力的影響提供了一定的理論支持。

PepA蛋白在溶藻弧菌的功能及其乙?；{(diào)控尚未見相關(guān)報(bào)道，本研究擬構(gòu)建溶藻弧菌 HY9901 PepA蛋白的原核表達(dá)載體、優(yōu)化其表達(dá)條件，并分析其是否存在乙?；{(diào)控，旨為探究乙?；鞍仔揎棇?duì)溶藻弧菌PepA蛋白功能的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

溶藻弧菌HY9901保存在廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。表達(dá)載體pET-28a由實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌BL21（DE3）均購(gòu)自北京全式金生物公司。細(xì)菌基因組提取試劑盒（Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit）、質(zhì)粒提取試劑盒、切膠回收試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司（Thermo Fisher Scientific），一抗是購(gòu)自Cell Signaling Technology的兔抗乙酰化賴氨酸抗體（Acetylated-Lysine Antibody），二抗是購(gòu)自科敏生物公司的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（Goat Anti-rabbit IgG/HRP），封閉液是碧云天的 QuickBlock Western，His標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)是碧云天公司的 BeyoGold His-tag Purification Resin（耐變性劑型），CobB（0.1 μg/μL）蛋白為前期實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 方法

1.2.1pepA基因的克隆與構(gòu)建pET-28a-PepA表達(dá)載體 將HY9901菌種加入200 mL TSB培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600nm達(dá)0.8時(shí)，使用細(xì)菌基因提取試劑盒，按說明書提溶藻弧菌HY9901的DNA。根據(jù)NCBI上已公布的溶藻弧菌pepA基因（ID：NC_022349.1）序列分別設(shè)計(jì)含EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)的正反鏈引物，正鏈引物F：CCGGAATTCATGGAGTTCAGTGTAA AAAGTGGC（下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn)），反鏈引物R：CCGCTCGAGTTACTCTTCTGTCTCTTGGCCGC（下劃線為XhoI酶切位點(diǎn)）。以溶藻弧菌HY9901的DNA為模板鏈擴(kuò)增pepA基因，PCR反應(yīng)體系為95℃ 5 min，95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。擴(kuò)增的目的片段用切膠純化試劑盒回收。pET-28a按照質(zhì)粒提取試劑盒說明提質(zhì)粒，用EcoRI和XhoI酶切，將切膠回收的產(chǎn)物與酶切后的pET-28a連接，用T4連接酶在16℃連接3 h后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)中，經(jīng)無抗性的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h再涂布在含kana抗性（100 μg/mL）的平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，鑒定所用引物 序 列 為F：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG，R：TAATACGACTCACTATAGGG。鑒定為陽(yáng)性菌落后經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)送到廣東生工生物公司進(jìn)行測(cè)序，保證pET-28a-PepA載體序列的正確性。

1.2.2 PepA蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將含pET-28a-PepA重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）以1%的體積分?jǐn)?shù)接種于含kana（100 μg/mL）抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)2 h，再加入體積分?jǐn)?shù)為0.5%的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，以不含IPTG的pET-28a-PepA、含IPTG的pET-28a、不含IPTG的pET-28a為對(duì)照組。37℃，200 r/min搖5 h后離心收集菌液。隨后用12 000 r/min離5 min再用1 mL的PBS洗，如此重復(fù)3次洗掉殘留培養(yǎng)基。采用水煮法提取細(xì)菌蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析。

1.2.3 PepA蛋白表達(dá)條件優(yōu)化 采用控制變量法，對(duì)于不同溫度、時(shí)間、IPTG濃度條件下重組菌株的表達(dá)效果進(jìn)行比較。當(dāng)OD600nm達(dá)0.4-0.6時(shí)開始誘導(dǎo)。

溫度：分別在37℃和28℃，IPTG濃度為0.5%搖5 h收集10 mL菌液，然后4℃ 6 000 r/min離心30 min，再用5 mL的PBS吹勻沖洗，如此重復(fù)兩次。置于冰水混合物中超聲波破碎重組細(xì)菌，超聲波程序設(shè)置為：功率300 W，超聲開時(shí)間5 s，超聲關(guān)時(shí)間8 s，超聲破碎20 min至菌液清澈透亮即可。然后分裝上清和沉淀，沉淀用8 mol/L尿素在4℃條件下溶解過夜，經(jīng)過SDS-PAGE后用考馬斯亮藍(lán)染色，用Gel-pro Analyzer 分析結(jié)果。

時(shí)間：在37℃，IPTG濃度為0.5%的條件下，誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)置為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h和7 h。菌液收集、處理及分析如1.2.2的步驟。

IPTG濃度：在37℃，誘導(dǎo)時(shí)間為5 h的條件下，IPTG濃度設(shè)置為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和2.0%。菌液收集、處理及分析如1.2.2的步驟。

1.2.4 His-PepA蛋白的純化 將最優(yōu)表達(dá)條件下誘導(dǎo)的菌株收集、提取蛋白，使用His標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)過柱純化。將蛋白與填料在4℃中孵育過夜，將孵育過夜的蛋白加入純化柱中，按碧云天公司的His標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)使用說明書操作。

1.2.5 Western blot驗(yàn)證PepA蛋白的?；?驗(yàn)證CobB蛋白能否在體外將PepA蛋白進(jìn)行去乙酰化。PBS*（去乙酰化酶磷酸緩沖液）反應(yīng)體系如下：50 mmol/L Na2HPO4（pH 8.0），100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，2.7 mmol/L KCl及500 μmol/L NAD+；CobB蛋白和 PepA（0.2 μg/μL）蛋白，充分混合，反應(yīng)總體積為500 μL。把純化后的融合蛋白E3以300 μL分別加入200 μL PBS*、100 μL NAD+和100 μL PBS*、100 μL CobB和PBS*、100 μL CobB和100 μL NAD+四組中。以加入PBS*的反應(yīng)作為陰性對(duì)照。所有反應(yīng)體系均置于25℃孵育6 h。待反應(yīng)完成后，取適量反應(yīng)體系加入等體積SDS-PAGE電泳蛋白質(zhì)上樣緩沖液終止反應(yīng)，使用Western blot法檢測(cè)樣品中目的蛋白的乙?；剑儆蔑@色液和自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（TAN 5200）拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 pepA基因的克隆

挑取菌落經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定獲得目的條帶（圖1），電泳后顯示的條帶大小與PepA ORF大小一致。表明pepA基因克隆成功。

圖1 pepA基因的克隆

2.2 重組質(zhì)粒pET-28a-PepA的構(gòu)建

重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中后進(jìn)行菌落PCR鑒定，條帶與預(yù)測(cè)大小一致（圖2），隨即送到廣州生物生工公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與預(yù)測(cè)序列完全一致，證明此載體構(gòu)建成功。

圖2 構(gòu)建pET-28a-PepA載體

2.3 誘導(dǎo)PepA蛋白表達(dá)

將構(gòu)建成功的重組菌株以37℃、0.5%的IPTG誘導(dǎo)5 h后收集蛋白，結(jié)果顯示未誘導(dǎo)的pET-28a、誘導(dǎo)過的pET-28a和未誘導(dǎo)的pET-28a-PepA均不表達(dá)，而經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌株得到一條60.7 kD的條帶（圖3），表明pepA基因在表達(dá)菌株中成功表達(dá)。

2.4 PepA蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

2.4.1 溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響 溫度優(yōu)化結(jié)果表明，PepA蛋白在兩個(gè)溫度條件下融合蛋白、上清和沉淀均有表達(dá)，且包涵體表達(dá)量均高于上清。在37℃的情況下，融合蛋白、上清和沉淀分別高于在28℃時(shí)的（圖4）。

圖3 PepA蛋白SDS-PAGE電泳分析

圖4 溫度對(duì)PepA蛋白表達(dá)的影響

2.4.2 IPTG濃度對(duì)重組蛋白的影響 結(jié)果表明，PepA在體積分?jǐn)?shù)為0.1%-2%的IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)量無明顯差異，即IPTG濃度對(duì)PepA表達(dá)量無明顯影響（圖5）。

圖5 IPTG濃度對(duì)PepA蛋白表達(dá)的影響

2.4.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白的影響 結(jié)果表明，PepA蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間增加而呈現(xiàn)出先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)，即5 h表達(dá)量達(dá)到最大且不再有明顯的增加，即誘導(dǎo)時(shí)間5 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間（圖6）。綜上所述，PepA蛋白最佳表達(dá)條件為37℃、0.1%的IPTG和誘導(dǎo)5 h。

圖6 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)PepA蛋白表達(dá)的影響

2.5 His-PepA蛋白的純化

融合蛋白經(jīng)his親和層析柱純化后，用SDSPAGE進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在第3次洗脫（E3）時(shí)成功純化（圖7）。

圖7 PepA蛋白的純化

2.6 PepA蛋白的乙?；b定

本研究使用抗乙酰賴氨酸抗體進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析，以測(cè)試PepA的乙?；健＝Y(jié)果表明（圖8，line 5）PepA蛋白自身存在乙?；揎椢稽c(diǎn)，即Pepa蛋白是個(gè)乙酰化蛋白。為了進(jìn)一步證實(shí)PepA和CobB之間的關(guān)系，對(duì)PepA進(jìn)行了去乙酰作用，并使用抗乙酰賴氨酸抗體對(duì)蛋白質(zhì)的乙?；竭M(jìn)行了分析，1-4的條帶顏色深淺沒有明顯差異，表明CobB蛋白不能調(diào)控PepA蛋白的乙?；揎棾潭然蛘邔?duì)其調(diào)控程度很?。▓D8）。

圖8 PepA蛋白的乙酰化鑒定及調(diào)控

3 討論

目前關(guān)于乙?；揎椀难芯枯^多，如對(duì)認(rèn)知障礙功能［17］、癌癥相關(guān)［18］及肉類品質(zhì)的影響［19］等研究。目前為止發(fā)現(xiàn)了兩種蛋白質(zhì)乙?；问剑嘿嚢彼嵋阴；蚇末端乙?；?0］，N末端乙?；枪J(rèn)的主要的細(xì)胞調(diào)節(jié)劑［21］，而賴氨酸乙?；推渌g后修飾聯(lián)合起來可以控制整個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路［22］。

目的蛋白的產(chǎn)生量很大程度上受原核表達(dá)的不同誘導(dǎo)條件的影響，故進(jìn)行目的蛋白的原核表達(dá)條件優(yōu)化是必要的。本試驗(yàn)在設(shè)置誘導(dǎo)參數(shù)時(shí)參照溶藻弧菌TolB與dtd基因的原核表達(dá)條件優(yōu)化［23-24］，得出在一定范圍內(nèi)IPTG濃度不會(huì)增加目的蛋白表達(dá)量，這與丁軍穎等［25］的IPTG濃度在一定范圍內(nèi)對(duì)丁肝抗原蛋白表達(dá)量無影響的研究結(jié)果有相似之處；而在37℃時(shí)目的蛋白表達(dá)量高于27℃，這可能是由于大腸桿菌酶活性在37℃較高有關(guān)；而目的蛋白表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間先上升后趨于平穩(wěn)，在5 h時(shí)達(dá)到最高，這說明長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)并不能使蛋白表達(dá)量一直增高。

“Nε-賴氨酸乙?；荒芡ㄟ^酶促或者非酶促兩個(gè)途徑完成，而去乙?；瘎t需要通過去乙?；窩ObB來完成。迄今為止，大腸桿菌中已鑒定出的去乙酰化酶只有CobB一種，CobB是一種需要NAD+的參與才能調(diào)控乙?；揎椀拿浮保?6-27］。本試驗(yàn)采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證PepA蛋白是否是去乙酰化蛋白以及去乙?；疌obB蛋白對(duì)目的蛋白的乙?；{(diào)控程度。經(jīng)研究得出CobB不能調(diào)控PepA蛋白的乙酰化修飾，說明PepA蛋白不是CobB反應(yīng)的底物，這可能是賴氨酸上乙?；鶊F(tuán)通過CobB以外的其它去乙?；富蚱渌ヒ阴；绞揭瞥?8］，此猜想還待未來印證。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建溶藻弧菌PepA重組表達(dá)菌株，其最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件為0.1% IPTG，37℃誘導(dǎo)5 h；經(jīng)鑒定PepA蛋白是乙?；鞍祝以隗w外不存在去乙?；?。