王丹 李圣彥 劉進平 郎志宏

（1. 海南大學熱帶作物學院，?？?570100；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

玉米（Zea maysL.）是重要的糧食和經(jīng)濟作物，但蟲害嚴重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)［1］。防治害蟲是保證玉米穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)的關(guān)鍵因素。在漫長的進化過程中，植物對植食性昆蟲形成了復(fù)雜的防御機制，以植物受到昆蟲為害后采取的防御措施不同分為直接防御和間接防御［2-5］。植物通過產(chǎn)生有毒或不易消化的化合物等方式直接影響害蟲的生理和行為，從而達到防御作用，這種方式被稱為直接防御；間接防御是指植物受到昆蟲為害后能夠產(chǎn)生揮發(fā)性化合物，吸引害蟲的天敵過來寄生或捕食，從而達到自我保護的防御方式。其中萜類化合物在玉米的防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用［6］。

萜類化合物（異戊二烯類化合物）是植物產(chǎn)生種類最多的化合物，迄今為止報道的超過80 000種。萜類化合物在植物的生命活動中起著非常重要的作用，例如影響果實的風味［7］，花的香味［8］和防御害蟲［9-11］等。在植物的間接防御過程中，萜類化合物扮演著重要的角色，比如煙草（Nicotiana attenuata）通過釋放揮發(fā)性萜類化合物（cis-3-Hexen-1-ol、linalool和cis-bergamot）吸引鱗翅目害蟲的天敵，減少了鱗翅目害蟲產(chǎn)卵率［12］；玉米被鱗翅目幼蟲啃食后會釋放出大量的萜類揮發(fā)物，雌性寄生蜂會根據(jù)萜類揮發(fā)物來定位幼蟲［13］。

植物的防御反應(yīng)大多是通過不同的激素信號途徑進行調(diào)控，植物萜類合成酶基因同樣也受不同的激素信號途徑調(diào)控。茉莉酸甲酯（MeJA）處理過的植物增加了揮發(fā)性萜類釋放，吸引捕食者和寄生類動物：MeJA處理玉米幼苗，可提高葉片中tps10基因（Zm00001d024486）的表達，從而產(chǎn)生更多的（E）-β-farnesene和（E）-α-bergamotene［14］；Yoshitomi等［15］發(fā)現(xiàn)JA誘導(dǎo)水稻（Oryza sativaL.）萜烯合酶tps24（Os04g27790）高表達，催化產(chǎn)生萜烯類揮發(fā)物并參與水稻防御系統(tǒng)。水楊酸（SA）可以直接被修飾形成其衍生物水楊酸甲酯（MeSA），MeSA也有類似的誘導(dǎo)萜類物質(zhì)產(chǎn)生的功效［16］。用MeSA處理利馬豆后增加了兩個高萜類化合物的釋放，它們能夠吸引覓食的捕食螨（Tetranychus urticae）［17］。植物激素乙烯（ET）也在誘導(dǎo)萜類揮發(fā)物的產(chǎn)生和植物防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在松樹［18］、洋蔥［19］和番茄［20］等多種植物中都觀察到了昆蟲危害后ET水平上升，用1-甲基環(huán)丙烯（一種乙烯感知抑制劑）阻止ET的感知可減少草食動物引起的揮發(fā)物釋放［21］，這表明ET在植物防御中發(fā)揮作用。

研究表明用機械損傷結(jié)合毛蟲的口腔分泌物處理玉米幼苗，誘導(dǎo)tps2基因（Zm00001d015053）表達量顯著升高［22］，說明tps2基因與玉米的蟲害應(yīng)答相關(guān)。TPS2可以催化產(chǎn)生單萜烯、倍半萜烯和二萜烯——分別為芳樟醇（Linalool）、（E）-橙花叔醇（（E）-nerolidol）和（E，E）-香葉基芳樟醇（（E，E）-geranyllinalool）。橙花叔醇和香葉基芳樟醇可由P450單加氧酶CYP92C5（Zm00001d018839）和CYP92C6（Zm00001d007918）通過氧化降解轉(zhuǎn)化為DMNT（（3E）-4，8-dimethyl-1，3，7-nonatriene）和TMTT（（E，E）-4，8，12-trimethyl-trideca-1，3，7，11-tetraene）。早 在1990年，Dicke等［23］發(fā) 現(xiàn)被螨蟲侵害的利馬豆（Phaseolus lunatus）能散發(fā)出DMNT和TMTT，吸引螨蟲的寄生天敵——雌性智利小植綏螨（Phytoseiulus persimilis），之后又在多種植物中發(fā)現(xiàn)DMNT和TMTT的類似響應(yīng)蟲害的功效，為明確玉米TPS2的生物學功能及其表達調(diào)控機制，本研究以tps2基因及其啟動子為研究對象，分析了植物激素（JA、SA、ET）和黏蟲對tps2基因的誘導(dǎo)表達作用，利用轉(zhuǎn)基因方法提高玉米中tps2基因的表達量，發(fā)現(xiàn)TPS2OE玉米植株對玉米螟的抗性提高，tps2啟動子必需的功能區(qū)段在-183至-129之間，為下一步對tps2基因的調(diào)控機制研究打下基礎(chǔ)。對TPS2生物學功能的研究，有助于我們在分子層面解析玉米的防御響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，了解植物防御害蟲的機制，可以通過調(diào)控防御基因表達，使防御性化合物在植物中產(chǎn)生，以抵抗植食性昆蟲攻擊，為培育玉米抗蟲抗逆新品種提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米自交系B73種子由中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所郎志宏課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 玉米材料的種植 將營養(yǎng)土和蛭石按1∶1的比例混合均勻，裝滿小花盆（7×7×8 cm），每盆點播5粒玉米種子，深度約2 cm，托盤內(nèi)澆足夠的水。在人工氣候室培養(yǎng)發(fā)芽，光周期設(shè)為16 h（L）/8 h（D），溫度25℃，濕度40%左右，光照強度為12 000 lx。

1.2.2tps2生物信息學分析 玉米萜類合成酶進化樹分析：在MaizeGDB（www.maizegdb.org/）網(wǎng)站上將玉米中已知的萜類合成酶基因的氨基酸序列下載，用MEGA7進行多序列比對，用Neighbor joining的方法做進化樹分析。

玉米TPS2進化樹分析：下載TPS2氨基酸序 列 在Phytozome（phytozome.jgi.doe.gov/）網(wǎng) 站 上BLAST，下載同源性相近蛋白的氨基酸序列。用MEGA7進行多序列比對，用Neighbor joining的方法做進化樹分析。

1.2.3 植物材料的處理

1.2.3.1 植物激素處理玉米幼苗 選取兩周大的玉米幼苗，分別用茉莉酸甲酯100 μmol/L，水楊酸30 μmol/L，乙烯利50 μmol/L（使用之前分別加入0.1%Tween20）進行處理。取樣部位：葉片和根。用含0.1%Tween20的水噴施幼苗后立即取樣，作為處理0 h樣品，處理后2、4、6、8 h分別取樣。取樣后提取RNA，進行qRT-PCR檢測。

1.2.3.2 蟲害處理玉米幼苗 黏蟲（Mythimna separata）卵塊購自美延（北京）農(nóng)業(yè)科技有限責任公司。卵塊在28℃溫箱中孵化出黏蟲幼蟲。用B73玉米葉片飼喂黏蟲幼蟲到3齡。選取兩周大的玉米自交系B73幼苗進行蟲害處理。在接種黏蟲之前取樣作為0 h。每棵玉米苗接一頭黏蟲幼蟲，幼蟲取食2、6、12、24 h時分別取玉米葉片和根提取RNA，進行qRT-PCR檢測。

1.2.4 TPS2OE載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 從Maize GDB（www.maizegdb.org/）網(wǎng)站下載玉米自交系B73的tps2CDS，用Primer Premier 5 軟件設(shè)計無縫克隆引物，引物序列為：tps2-F：5'-TGTTGTTTGGTGTTAC TTCTGCAGATGTACTCTCTACCAGGAGC-3'，tps2-R：5'- GAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTCAAAGCA CCAACATCATCG-3'。以JA處理2 h后的B73葉片cDNA為模板進行PCR擴增，50 μL反應(yīng)體系：5×Buffer 10 μL，dNTP Mix 1 μL，正向和反向引物（10 μmol/L）各2 μL，模 板cDNA 1 μL，Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 23 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 90 s，33個循環(huán)；72℃ 10 min；15℃ 2 min終止反應(yīng)。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化目的片段（tps2CDS），無縫克隆試劑盒（Clone Smarter，美國）連接pCAMBIA3300-Ubi-nos載體，獲得由玉米ubiquitin啟動子驅(qū)動的tps2基因的雙元載體pUTPS2N，轉(zhuǎn)化玉米，獲得陽性植株用于后續(xù)實驗。

1.2.5 玉米葉片揮發(fā)物的GC-MS分析 測定材料為玉米自交系B73和轉(zhuǎn)基因玉米TPS2OE。取兩周大小玉米葉片20 mg，研磨成粉。42℃固相萃取45 min。采用GC-QTOF氣質(zhì)聯(lián)用儀分析樣品揮發(fā)物成分。色譜柱為EC5-MS色譜柱（長30 m，內(nèi)徑0.25 mm和厚度0.25 μm）。氣相色譜參數(shù)設(shè)定如下：載氣為氦氣，流速1 mL/min，不分流模式。進樣口溫度設(shè)為220℃，升溫程序：初始溫度50℃ 2 min，以8℃/min升溫至300℃，保持2 min。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定如下：傳輸管溫度270℃，離子源溫度270℃，電離電位70 eV，掃描范圍40-600 m/z。揮發(fā)性色譜圖顯示了總離子色譜圖，其中包含同一掃描的所有質(zhì)譜峰的強度總和。鑒別揮發(fā)性物質(zhì)時，將MassHunter Qualitative DA Software與 質(zhì) 譜 庫Wiley8（Hewlett Packard）和Adams（Adams，2007）一起使用。一式三份進行測定，并通過軟件（Aligent MassHunter Analysis）進行相對定量分析。

1.2.6 亞洲玉米螟行為選擇實驗 亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）的蟲蛹是由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。自制紗網(wǎng)籠子（圖1）的兩側(cè)分別擺放TPS2OE和對照B73玉米材料，中間位置擺放60個玉米螟蛹（40個雌蛹和20個雄蛹），設(shè)置3個生物學重復(fù)，并將紗網(wǎng)籠子放到光照培養(yǎng)箱中：設(shè)置光周期16 h（L）/8 h（D），光照強度12 000 lx，溫度25-28℃，濕度40%-60%。

待蛹羽化成蛾后，在籠子里放3%蔗糖水，供成蟲吸食補充營養(yǎng)。產(chǎn)卵結(jié)束后，成蟲陸續(xù)死亡，再等5 d至幼蟲孵化，啃食玉米幼苗，統(tǒng)計不同實驗材料上的卵的個數(shù)、幼蟲數(shù)目，并將每棵幼苗葉片分別拍照，根據(jù)照片中的比例尺，用Photoshop軟件計算蟲害面積（cm2）。對比實驗組和對照組數(shù)據(jù)，使用SAS軟件進行差異顯著性分析，并用prism軟件作圖。

圖1 玉米螟行為選擇實驗設(shè)計

1.2.7 啟動子截短表達載體構(gòu)建及原生質(zhì)體瞬時表達分析 啟動子截短及表達載體構(gòu)建：在MaizeGDB（www.maizegdb.org/）網(wǎng)站下載tps2基因翻譯起始位點上游1.5 kb的核酸序列，用Primer Premier 5軟件設(shè)計無縫克隆引物（表1），PCR擴增獲得5'端截短的不同長度tps2啟動子，分別為968 bp、737 bp、485 bp、327 bp、227 bp、183 bp、129 bp、61 bp，將8個片段從大到小命名為F1-F8，通過無縫克隆連接到LUC雙熒光載體pGreenⅡ 0800-Luc上。植物表達載體pGreenⅡ 0800-Luc上含有兩個報告基因：海參熒光素酶基因（Ren）作為內(nèi)參基因；螢火蟲熒光素酶基因（Luc）作為目標啟動子報告基因。通過兩種熒光值的比值（Luc/Ren）來表征目標啟動子的活性。

原生質(zhì)體瞬時表達：根據(jù)李圣彥［24］描述的方案進行玉米葉片原生質(zhì)體分離和PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，每次轉(zhuǎn)化10-20 μg載體，每個載體進行3次生物學重復(fù)。孵育12 h后，收集原生質(zhì)體細胞，并在液氮中速凍，用熒光素酶檢測系統(tǒng)（Dual-Luciferase Reporter Assay System，Promega，美國）及化學發(fā)光檢測儀（Promega GloMax，美國）測定雙熒光值。

2 結(jié)果

2.1 玉米TPS2的生物信息學分析

玉米中已報道18個萜類合成酶，將18個萜類合成酶的氨基酸序列經(jīng)進化樹分析（圖2）可以看出，有些序列相似性極高（圖2），如tps4/tps5、tps6/tps11、tps2/tps3等，相似性在95%以上，只有個別氨基酸的差別，這些基因可能是基因組復(fù)制（Duplication）產(chǎn)生，基因功能是否存在冗余，將在下一步中研究。有些序列相似性很低，不同的萜類合成酶催化產(chǎn)生不同的單萜、二萜、倍半萜和多萜類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)的不同導(dǎo)致各自的功能不盡相同，表達部位也存在差異，說明玉米萜類合成酶在進化上的復(fù)雜性。

表1 用于擴增不同長度tps2啟動子的引物序列

在水稻、高粱、狗尾草、二穗短柄草和擬南芥中存在著與tps2基因相似性高的基因，通過同源檢索，有Ostps、Sbtps14等基因與玉米tps2基因相似性高于90%，將這些基因與tps2基因進行進化樹分析，tps2基因與來源于高粱、狗尾草和水稻的萜類合成酶基因聚在一起，并與雙子葉植物擬南芥的萜類合成酶基因有很高的序列相似性（圖3）。說明tps2基因在進化中具有高度保守性，TPS2能催化產(chǎn)生單萜、倍半萜和二萜烯類化合物，在植物防御反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。

2.2 不同激素和黏蟲處理條件下tps2基因的表達模式

通過qPCR檢測在3種激素處理條件下的不同時間點、不同組織部位中tps2的相對表達量（圖4）。結(jié)果顯示在B73中，tps2受JA、SA和ET誘導(dǎo)表達，表達部位主要是葉片，根部的表達量極低。其中，JA處理2 h時，葉片中tps2的相對表達量最高，升高了10倍左右（圖4-A）；SA處理4 h時，葉片中tps2的相對表達量達到最高，約升高了20倍（圖4-B）；ET處理6 h后，tps2的表達量達到頂峰，約升高了8倍（圖4-C）；黏蟲（AW）危害2 h后tps2的表達量顯著升高，約提高了15倍（圖4-D）。植物的防御反應(yīng)多是通過不同的激素信號途徑進行調(diào)控，尤其是JA信號途徑與防御害蟲反應(yīng)直接相關(guān)。實驗結(jié)果表明JA、SA、ET都對tps2有誘導(dǎo)作用，但是其誘導(dǎo)反應(yīng)的時間不同。蟲害處理直接導(dǎo)致了tps2的高表達，說明tps2參與了防御害蟲的信號通路。

圖2 玉米萜類合成酶進化樹分析

2.3 轉(zhuǎn)基因玉米TPS2OE的獲得及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測

為了研究tps2基因的生物學功能，構(gòu)建tps2基因的超表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米，共獲得5個獨立轉(zhuǎn)化體，對5個轉(zhuǎn)化體中tps2基因轉(zhuǎn)錄水平最高的TPS2OE-1轉(zhuǎn)化體做進一步的分析。

TPS2OE幼苗通過實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）檢測tps2的相對表達量，B73作為對照材料。檢測結(jié)果顯示與B73相比，TPS2OE葉片和根中的tps2的表達量均顯著上升，在葉片中提高了12倍，在根中提高了143倍（圖5）。結(jié)果表明在轉(zhuǎn)錄水平上tps2基因表達得到了顯著提高。

TPS2誘導(dǎo)底物產(chǎn)生橙花叔醇和香葉基芳樟醇，再由P450單加氧酶CYP92C5和CYP92C6進一步氧化降解為DMNT和TMTT。qPCR檢測cyp92c5和cyp92c6基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況，結(jié)果表明cyp92c5在B73和TPS2OE中表達量極低；cyp92c6則有較高的表達量，且葉中表達量顯著高于根；cyp92c6在B73和TPS2OE中的表達量無明顯差異，說明tps2基因的過表達并未影響cyp92c5和cyp92c6基因的表達情況（圖6）。

2.4 GC-MS檢測TPS2OE的揮發(fā)性萜類表達量增高

B73和TPS2OE葉片材料用液氮研磨成粉，頂空吸附進樣。用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS，Agilent 7200 Accurate-Mss Q-TOF）檢測TPS2主要催化產(chǎn)物TMTT的含量差別。GC-MS檢測結(jié)果顯示：與對照組B73相比，TPS2OE中TMTT產(chǎn)量明顯升高（圖7）。

2.5 TPS2對玉米螟行為選擇的影響

將亞洲玉米螟蛹置于B73和TPS2OE幼苗之間，玉米螟羽化成蛾后在B73和TPS2OE幼苗上的產(chǎn)卵數(shù)無顯著差別，表明TPS2OE對成蟲的產(chǎn)卵選擇無影響（圖8-A）；然而B73幼苗上棲息的幼蟲數(shù)顯著高于TPS2OE（圖8-B），由此推測TPS2OE產(chǎn)生過多的萜類揮發(fā)物抑制了玉米螟蟲卵的孵化，或者對玉米螟幼蟲有驅(qū)避作用；此外，TPS2OE幼苗受到的危害面積顯著小于B73組（圖8-C），說明過表達tps2基因能在一定程度上增強防御玉米螟的能力。

2.6 tps2啟動子截短和植物表達載體的構(gòu)建

PCR擴增不同長度的tps2啟動子序列（圖9-A），并且通過無縫克隆試劑盒連接到目的載體pGreenⅡ0800-Luc上（圖9-B）。

2.7 tps2啟動子的必需的功能區(qū)段為-183至-129

分析截短不同長度的啟動子片段的熒光比值（Ratio）差異。當啟動子長度大于等于227 bp時，Ratio基本保持在0.5左右；當啟動子為183 bp時，Ratio達到最大值約1.5；但是繼續(xù)截短到129 bp，則Ratio約為0，即該啟動子片段沒有啟動轉(zhuǎn)錄的活性（圖10）。說明tps2啟動子必需的功能區(qū)段在-183至-129之間，并且-227至-183之間存在負調(diào)控元件，或者該區(qū)段能產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)，對啟動轉(zhuǎn)錄活動起到抑制作用。

圖3 玉米TPS2和其他物種的萜類合成酶系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

植物激素是調(diào)節(jié)生長發(fā)育的低濃度小信號分子，大量研究表明，它們在激活植物的自我保護系統(tǒng)中起著重要的作用［25-26］，其中SA、JA和ET是針對多種病原體和植食性昆蟲的抗性信號網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素［27-28］。萜類化合物是植物防御的關(guān)鍵次生代謝物，而植物的防御與植物激素代謝通路息息相關(guān)。在玉米自交系B73中，JA、SA、ET都對tps2有誘導(dǎo)作用，但是其誘導(dǎo)反應(yīng)的時間不同，tps2參與植物激素信號通路的反應(yīng)時間不同，可能與各信號途徑之間的crosstalk相關(guān)。蟲害處理直接導(dǎo)致了tps2的高表達，說明tps2參與了防御害蟲的信號通路。已知JA、SA和ET的信號通路在各個節(jié)點之間相互作用，例如激素響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子以調(diào)節(jié)植物防御反應(yīng)［29］。但是，值得注意的是，植物在脅迫條件下適當防御反應(yīng)和持續(xù)生長是適應(yīng)環(huán)境的關(guān)鍵特征。而且，植物響應(yīng)不同脅迫而激活的防御反應(yīng)取決于激素信號傳導(dǎo)途徑之間的crosstalk（正向或負向），而不僅取決于每種激素的單獨貢獻［30］。例如，引發(fā)SA介導(dǎo)的防御反應(yīng)的丁香假單胞菌感染擬南芥植物，通過抑制ET/JA信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致對壞死菌的抵抗力大大降低［31］。玉米tps2基因在JA、SA和ET不同激素信號通路中如何受多重調(diào)控以及在不同激素的crosstalk中如何行使功能需要進一步研究。

圖4 不同植物激素（JA、SA和ET）和黏蟲（AW）誘導(dǎo)tps2基因表達分析

圖5 在轉(zhuǎn)錄水平上B73和TPS2OE植株中tps2基因的表達情況

圖6 cyp92c5和cyp92c6基因在B73和TPS2OE中的表達情況

圖7 TPS2OE和B73玉米中TMTT的GC-MS分析

圖8 玉米螟對B73和TPS2OE幼苗的行為選擇

為了明確TPS2的功能，構(gòu)建了tps2基因的超表達載體，轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因玉米TPS2OE，在TPS2OE玉米葉片中tps2轉(zhuǎn)錄水平較自交系B73增加了12倍，在根中表達量提高了143倍。同時TPS2的主要催化產(chǎn)物TMTT也得到顯著提升。有研究表明，萜類化合物對一些害蟲具有驅(qū)避性，如Bruce等［32］研究表明順式茉莉酸處理后的棉花能夠誘導(dǎo)TMTT產(chǎn)生，并且其對棉蚜有驅(qū)避作用。本研究發(fā)現(xiàn)TPS2OE和B73玉米對玉米螟幼蟲數(shù)量和葉片的危害程度存在顯著差異，說明TPS2在玉米的害蟲防御中起著重要作用，但導(dǎo)致這一結(jié)果的原因是萜類揮發(fā)物抑制了玉米螟蟲卵的孵化，還是對玉米螟幼蟲有驅(qū)避作用還有待進一步研究。此外，前人研究發(fā)現(xiàn)植物產(chǎn)生的DMNT和TMTT還起到間接防御的作用。Turlings等［13］發(fā)現(xiàn)害蟲褐邊綠刺蛾（Latoia consocia）能誘導(dǎo)玉米產(chǎn)生DMNT和TMTT，并有效地吸引了雌性甜菜夜蛾盤絨繭蜂（Cotesia marginiventris）定位宿主并寄生；棉花被毛蟲取食后都能夠釋放出DMNT和TMTT，并且強烈地吸引害蟲天敵——雌性寄生蜂［33］；DMNT和TMTT還誘導(dǎo)鄰近的未受害蟲侵害的植物發(fā)生防御反應(yīng)，與未處理的利馬豆植株相比，放在二斑葉螨誘導(dǎo)氣體物質(zhì)中的利馬豆植株對二斑葉螨有更高的抗性［34］。下一步我們也將針對TPS2OE玉米植株對寄生蜂的行為選擇進行研究。

圖9 截短tps2啟動子系列載體示意圖

圖10 LUC雙熒光分析tps2啟動子活性

亞洲玉米螟是我國玉米的主要害蟲，二代玉米螟多發(fā)生在抽絲盛期，對玉米籽粒危害嚴重。因此防治二代玉米螟對玉米籽粒的危害對玉米生產(chǎn)具有非常重要的意義。玉米苗期葉片中tps2基因受蟲害誘導(dǎo)表達，產(chǎn)生DMNT和TMTT吸引害蟲的天敵［33］，那么在玉米花粒期中tps2基因是否也發(fā)揮著同樣的作用？已有的研究表明正常條件下tps2基因在玉米籽粒中并不表達［35］，但對于蟲害或激素處理后玉米籽粒中tps2基因的表達情況并不清楚。在后續(xù)工作中我們將會對玉米雌穗（花絲、苞葉、籽粒）中tps2基因的表達模式進行研究，探究tps2基因在玉米花粒期的功能。

啟動子區(qū)段的順式作用元件與轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控小分子結(jié)合調(diào)控基因表達，tps2基因受多種激素誘導(dǎo)表達，在tps2的啟動子區(qū)段是否存在調(diào)控的激活區(qū)或者抑制區(qū)需要對啟動子進行分析，通過tps2啟動子5'端截短實驗發(fā)現(xiàn)tps2啟動子的必需的功能區(qū)段為-183至-129之間，在-227至-183區(qū)段存在負調(diào)控元件［36］，因為-227至-183區(qū)段的缺失使啟動子活性提高了2倍。目前對負調(diào)控元件的研究并不多，可以通過tps2啟動子3'端截短等方法，進一步確定其基元序列，從而進一步探究tps2的表達調(diào)控方式。

4 結(jié)論

Tps2是玉米防御反應(yīng)中的重要基因，qPCR結(jié)果表明tps2受植物激素（JA、SA、ET）和黏蟲的誘導(dǎo)表達。通過qPCR及GC-MS對超表達tps2基因玉米檢測分析，TPS2OE植株中的tps2轉(zhuǎn)錄水平明顯提高，且其主要催化產(chǎn)物TMTT也顯著高于B73。玉米螟行為選擇結(jié)果顯示，TPS2OE幼苗對雌蛾的產(chǎn)卵影響不大，但TPS2OE幼苗上玉米螟幼蟲較少，玉米葉片受到的危害較低，TPS2OE植株能夠在一定程度上增加玉米的自我防御能力。Tps2啟動子必需的功能區(qū)段在-183至-129之間，且-227至-183區(qū)段可能存在負調(diào)控元件。