顏春魯， 安方玉， 蔣國鳳， 趙崇博， 李嘉進， 李孟翰， 郭 丹

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學 中西醫(yī)結合學院， 蘭州 730000； 2. 甘肅中醫(yī)藥大學 教學實驗實訓中心， 蘭州 730000；3. 甘肅中醫(yī)藥大學 臨床醫(yī)學院，蘭州730000； 4. 甘肅中醫(yī)藥大學 中醫(yī)臨床學院， 蘭州 730000)

現(xiàn)代醫(yī)學認為，膝骨關節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是一種涉及膝關節(jié)軟骨、軟骨下骨并形成關節(jié)軟骨骨贅的慢性退行性關節(jié)病變，已成為老年人致殘最常見的關節(jié)退變性疾病[1]，其發(fā)病機制尚未完全明確。目前認為，KOA發(fā)病的根本原因是各種致病因素造成軟骨細胞的破壞和細胞外基質的合成與降解失衡。近年研究[2-4]也表明，炎性因子引發(fā)的關節(jié)腔內炎癥反應是導致KOA關節(jié)發(fā)生退變的另一重要因素，也是導致KOA患者出現(xiàn)關節(jié)疼痛的主要誘因，這些細胞因子主要包括白細胞介素(Interleukin，IL)、趨化因子(Chemotactic factor，CC)以及腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)等。白細胞介素-6(Interleukin，IL-6)是一種與多種炎癥介質具有協(xié)同作用的促炎因子，是調節(jié)關節(jié)軟骨炎癥反應的始動因素[5]。如：骨關節(jié)炎模型鼠關節(jié)腔內白細胞介素-1(Interleukin，IL-1)、IL-6及腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)表達水平的增加程度與炎癥嚴重程度存在正相關關系，可以作為骨關節(jié)炎疾病程度的參考指標[6]；IL-6和IL-1β還是造成KOA關節(jié)軟骨破壞和軟骨基質降解最主要的細胞因子[7]。IL-2是一類由Th1細胞分泌的細胞因子，過量分泌可引起局部慢性炎癥[8]，還可以刺激軟骨細胞分泌金屬蛋白酶，破壞或者抑制基質合成，引起單核巨噬細胞炎性浸潤，導致軟骨組織破壞，引起疾病發(fā)生[9]。研究結果表明，膝關節(jié)滑膜液內的細胞因子是KOA發(fā)生疼痛的主要原因[2]。

疼痛既是KOA最常見的臨床癥狀，也是大多數(shù)患者就診的主要原因。藤黃健骨膠囊具有補腎、活血、止痛等功效，臨床主要用于治療增生性關節(jié)炎和大骨節(jié)病等。有研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，藤黃健骨膠囊主要通過調控骨質疏松模型鼠的鈣磷代謝和OPG/RANK/RANKL調節(jié)軸來影響其骨密度和骨礦含量，實現(xiàn)其治療作用。藤黃健骨膠囊是否對KOA治療有效及其治療機制是什么，目前鮮見報道。因此，本研究采用改良后Hulth 法建立KOA大鼠模型，通過觀察藤黃健骨膠囊對KOA大鼠模型血細胞變化和炎癥因子變化的影響，初步探討藤黃健骨膠囊的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只SPF級SD雌性大鼠，體重(200±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗動物中心提供。實驗動物質量合格證編號：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 試劑及實驗藥物

水合氯醛(天津市光復精細化工研究所，批號：20150105)；慶大霉素(辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：1805312221)；Rat IL-2 ELISA Kit檢測試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：MM-0192R1)；Rat IL-6 ELISA Kit檢測試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：MM-0190R1)；藤黃健骨膠囊(甘肅省西峰制藥有限責任公司，規(guī)格0.25 g/粒，批號：503010)；仙靈骨葆膠囊(國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，規(guī)格0.5 g/粒，批號：190111)。

1.3 主要儀器

iMark型自動酶標分析儀(美國Bio-Rad公司)；FA2004N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機(湖南平凡科技有限公司)；SYSMEX型全血自動分析儀(上海玉研科學儀器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 實驗藥物給藥劑量

藤黃健骨膠囊，人的臨床用量為：2 g/d，按照人與大鼠的體表面積換算法2 g×0.018×5=0.18 g/kg作為中劑量，則藤黃健骨膠囊高、中、低劑量分別為0.36、0.18和0.09 g/kg。陽性對照藥仙靈骨葆膠囊，人的臨床用量為3 g/d，按照人與大鼠的體表面積換算法3 g×0.018×5=0.27 g/kg。

1.4.2 動物分組、造模及給藥

將 60 只 SD大鼠隨機分為假手術組、KOA模型組、陽性對照組(仙靈骨葆膠囊)以及藤黃健骨膠囊高、中、低劑量組，每組10只。除假手術組外，其余各組大鼠用改良Hulth 法[12-13]造模，采用10%質量分數(shù)的水合氯醛腹腔注射麻醉各組動物后，將其仰臥位固定于操作臺，作髕骨前長約3 cm的內側切口，逐層分離顯露髕骨，切除前交叉韌帶和內側半月板，行抽屜試驗陽性后逐層縫合切口。假手術組只作髕骨前長約3 cm的內側切口，逐層分離暴露關節(jié)腔，對前交叉韌帶、內側副韌帶和半月板均不作切除處理。術后3 d 各組大鼠給予慶大霉素以防感染。造模6周后假手術組、模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃方式，陽性對照組給予仙靈骨葆膠囊(0.27 g/kg)灌胃，藤黃健骨膠囊干預組給予高、中、低劑量的藤黃健骨膠囊(0.36、0.18和0.09 g/kg)灌胃治療，1次/d，連續(xù)干預8周。

1.4.3 HE染色觀察骨形態(tài)學變化

動物處死后取完整膝關節(jié)，將各組動物的右側膝關節(jié)脫鈣處理4周后，進行常規(guī)石蠟包埋，切約5μm厚度的切片，HE 染色，倒置在顯微鏡下觀察各組大鼠軟骨組織的形態(tài)學變化并進行 Mankin 評分，具體評分依據(jù)參考文獻[14]。

1.4.4 足跖腫脹厚度的測定

用游標卡尺分別測量各組大鼠造模前和干預后的右后足足跖厚度，用公式計算足跖腫脹度[15]。足跖腫脹度(mm)= 干預后足跖厚度(mm)-造模前足跖厚度(mm)。

1.4.5 外周血細胞變化的測定

末次給藥24 h后，腹腔注射10%質量分數(shù)水合氯醛麻醉各組動物，摘除各組動物的眼球，取血用全血自動分析儀測定各組大鼠白細胞(White blood cell，WBC)、中性粒細胞(Neutrophils，N)、淋巴細胞(Lymphocyte，L)、單核細胞(Monocyte，M)和嗜酸粒細胞(Eosinophils，EOS)水平。

1.4.6 血清IL-2和IL-6含量的測定

眼球采血，血標本靜置2～3 h，1500 r/min離心10 min分離血清。ELISA法檢測各組動物血清IL-2及IL-6含量等指標。具體操作按試劑盒說明書進行。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 對軟骨組織病理形態(tài)改變的影響

軟骨組織病理形態(tài)結果顯示：假手術組大鼠關節(jié)面及滑膜結構完整，軟骨細胞呈水平排列，關節(jié)軟骨邊緣光滑；KOA模型組大鼠關節(jié)面嚴重受損，軟骨細胞大量脫落；藤黃健骨膠囊低劑量組大鼠關節(jié)關節(jié)面受損比較嚴重，軟骨細胞排列紊亂；藤黃健骨膠囊中、高劑量組和陽性對照組大鼠關節(jié)面及滑膜結構趨于正常，軟骨細胞排列整齊，并呈水平排列。Mankin評分結果顯示：與假手術組比較，KOA模型組大鼠Mankin評分升高，有顯著性差異(P<0.05)；與KOA模型組比較，藤黃健骨膠囊中、高劑量組和陽性對照組大鼠Mankin評分均降低，有顯著性差異(P<0.05)。具體見圖1和表1。

(a)假手術組；(b)KOA模型組；(c)陽性對照組；(d)藤黃健骨膠囊高劑量組；(e)藤黃健骨膠囊中劑量組；(f)藤黃健骨膠囊低劑量組

表1 藤黃健骨膠囊對去KOA模型大鼠Makin評分的影響(±S，n=10)

2.2 對足跖腫脹的影響

與假手術組比較，KOA模型組右后足足跖腫脹顯著增強(P<0.05)；與KOA模型組比較，藤黃健骨膠囊各劑量組和陽性對照組大鼠右后足足跖腫脹顯著減輕(P<0.05)。具體見表2。

表2 藤黃健骨膠囊對KOA模型大鼠足跖腫脹的影響

2.3 對血細胞變化的影響

由表3可知：與假手術組比較，KOA模型組大鼠白細胞(White blood cell，WBC) 、中性粒細胞(Neutrophils，N)、中性粒細胞/淋巴細胞(Neutrophils/lymphocyte，N/ L)等指標均升高，淋巴細胞(Lymphocyte，L)的數(shù)目降低(P<0.05)；與假手術組比較，KOA模型組大鼠單核細胞(Monocyte，M)和嗜酸粒細胞(Eosinophils，EOS)的含量也減低，但無顯著性差異(P>0.05)；與KOA模型組比較，藤黃健骨膠囊中、高劑量組和陽性對照組N的數(shù)目明顯降低，L的數(shù)目明顯增加，藤黃健骨膠囊各干預組和陽性對照組的WBC和 N/L等指標均明顯降低(P<0.05)；與KOA模型組比較，藤黃健骨膠囊各劑量組和陽性對照組大鼠M和EOS的含量升高，但無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 對IL-2和IL-6含量的影響

由表4可知：與假手術組比較，KOA模型組大鼠IL-2含量和IL-6含量顯著升高(P<0.05)；與KOA模型組比較，藤黃健骨膠囊高劑量組和陽性對照組IL-2含量顯著降低，藤黃健骨膠囊各干預組和陽性對照組IL-6含量均顯著降低(P<0.05)。

3 討論與結論

中醫(yī)將KOA歸屬于“筋痹、骨痹”范疇[16]。中醫(yī)理論認為，膝關節(jié)的局部濕濁痹阻與氣滯血瘀是導致KOA的主要病機，而長期的濕濁痹阻與氣滯血瘀又會導致筋脈受阻、腎氣虧損、經(jīng)絡受到淤滯，故臨床治療中以補腎壯骨、利濕除痹、舒筋通絡、活血化瘀和行氣止痛為主。藤黃健骨膠囊組方：熟地黃具有補血滋陰、益精填髓的功效，為君藥；鹿銜草、骨碎補(燙)、肉蓯蓉、淫羊藿輔助君藥發(fā)揮補益肝腎、強筋健骨的功效，為臣藥；雞血藤具有補血、活血、通絡等功效，為佐藥；萊菔子具有消食除脹、降氣化痰的功效，為使藥?？梢?，藤黃健骨膠囊的組方原則與KOA的中醫(yī)病機是相吻合的。并已有研究[17-18]證明，藤黃健骨膠囊治療KOA有效。

表3 藤黃健骨膠囊對膝骨關節(jié)炎模型大鼠血常規(guī)的影響

表4 藤黃健骨膠囊對KOA模型大鼠IL-2和IL-6含量的影響

在KOA的發(fā)生發(fā)展過程中，膝關節(jié)會因各種原因造成關節(jié)滑膜的損傷，導致滑膜下層毛細血管的通透性上升，從而使大量的滲出液積聚在關節(jié)腔內，從而引起關節(jié)腫脹、疼痛等，引發(fā)關節(jié)炎癥反應。研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，在KOA模型大鼠中，促炎因子IL-1和IL-6可以促進關節(jié)炎癥細胞的浸潤，而大量炎癥細胞的浸潤反過來進一步促進了關節(jié)腔內液體的滲出，加重了關節(jié)軟骨組織的病理損傷、關節(jié)軟骨的破壞和退變，從而造成惡性循環(huán)。KOA模型組大鼠關節(jié)面嚴重受損，軟骨細胞大量脫落，Mankin評分升高和右后足足跖腫脹顯著增強，炎癥細胞WBC數(shù)目和N數(shù)目顯著增加，炎癥細胞因子IL-2含量和IL-6的含量也顯著升高，而藤黃健骨膠囊可以使KOA模型組大鼠的關節(jié)面及滑膜結構趨于正常，可以顯著降低KOA模型組大鼠的右后足足跖腫脹，顯著降低炎癥細胞WBC數(shù)目和N數(shù)目，同時也顯著降低其炎癥細胞因子IL-2含量和IL-6的含量。這說明藤黃健骨膠囊治療KOA有效，其具體機制可能是通過減少KOA機體炎癥細胞因子的分泌來減輕局部炎癥細胞的浸潤，減少關節(jié)液的滲出，從而改善關節(jié)軟骨組織的病理損傷，減輕關節(jié)軟骨的破壞和退變，從而發(fā)揮治療抗炎鎮(zhèn)痛的效果。但其具體的分子機制還需要進一步深入研究。