余永昊，謝定源，方妍，范剛，丁璐

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

辣椒(CapsicumannuumL.)，為木蘭綱、茄科、辣椒屬一年或有限多年生草本植物。適應(yīng)性強(qiáng)，在世界各地普遍栽培，具有悠久的調(diào)味、著色、保存食物和作為藥物的歷史[1]。辣椒果實(shí)是一種藥食同源的蔬菜，含有生物堿、色素、維生素、有機(jī)酸、礦物質(zhì)等成分[2]。其中辣椒素是辣椒果實(shí)中的一類(lèi)結(jié)構(gòu)為N-香草基酰胺類(lèi)生物堿的物質(zhì)[3]，有辣味[4]，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、促進(jìn)食欲、改善消化、減肥等藥理作用[5-8]。近年的研究還表明辣椒素具有抗氧化作用[9]。

辣椒中辣椒素的含量主要與辣椒品種、栽培條件和提取方法有關(guān)[10-11]。目前常用的從辣椒中提取辣椒素的方法主要有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和超臨界CO2萃取法[12]。溶劑提取法條件溫和，可最大程度保留辣椒中的活性成分，節(jié)約能源，但存在溶劑污染和辣椒素得率低的問(wèn)題[13]；超聲波輔助提取法方法簡(jiǎn)單，所用時(shí)間短，提取條件溫和，且具有較高的辣椒素得率[14-16]；微波輔助提取法勞動(dòng)強(qiáng)度低，可以大大減少溶劑消耗，且辣椒素提取率相對(duì)較高[17-19]；超臨界CO2萃取法不適用于實(shí)驗(yàn)室提取辣椒素，更適合商業(yè)化生產(chǎn)[20-21]。

以上提取方法適用于從辣椒原料中提取辣椒素，但無(wú)法用于從富含油脂的樣品中提取辣椒素。若不對(duì)富含油脂的樣品進(jìn)行前處理，把中性油脂和辣椒素分離，那么后續(xù)用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)和液質(zhì)聯(lián)用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)法對(duì)辣椒素進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，色譜柱極易被污染、堵塞，導(dǎo)致色譜柱的使用壽命大大減少[22-23]。目前國(guó)內(nèi)外從辣椒油中提取分離辣椒素的研究較少，若直接以70%乙醇在50 ℃水浴提取樣品2 h，研究發(fā)現(xiàn)，在醇水體系和油脂兩相共存時(shí), 辣椒素幾乎全部分配于醇水體系[24]；以Benzo I吸附劑為萃取填料，醫(yī)用3 mL聚丙烯注射器為容器制作萃取小柱，該法樣品前處理簡(jiǎn)單快捷，省時(shí)省力且有機(jī)溶劑消耗量低[25]；用氨基固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行前處理，辣椒素的平均回收率在70.6%～90.5%之間，且可有效去除油脂類(lèi)物質(zhì)及其他雜質(zhì)[26]。

本研究旨在利用固相萃取(solid-phase extraction，SPE)能較好且省時(shí)省力地將辣椒素從辣椒油中提取分離出來(lái)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)固相萃取過(guò)程中的相關(guān)條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，從而最終確定一種最佳的提取分離辣椒油中辣椒素的固相萃取工藝條件；采用HPLC對(duì)辣椒素進(jìn)行定性與定量[27-28]，并通過(guò)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)與日內(nèi)精密度和日間精密度實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)固相萃取最佳工藝條件的可行性，旨在用一種較優(yōu)的樣品前處理方式處理辣椒油，為后續(xù)辣椒素的檢測(cè)及其在油中的降解機(jī)理研究提供一個(gè)技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

“不怕辣”印度辣椒：山東樂(lè)暢調(diào)味品有限公司；金龍魚(yú)精煉一級(jí)大豆油：益海嘉里(武漢)糧油工業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑

辣椒堿(合成)標(biāo)品、二氫辣椒堿標(biāo)品：上海源葉生物科技有限公司；甲醇、異丙醇、乙腈(均為色譜純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙酮(色譜純)：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；正己烷(色譜純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯(色譜純)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

LC-20型高效液相色譜儀 日本島津公司；Platisil ODS液相色譜柱(250 mm，5 μm) 中國(guó)Dikma公司；LC-CQ-12F方形固相萃取儀 上海邦西儀器科技公司；HiCapt NH2固相萃取柱 武漢維泰克科技有限公司；Allegra X-30R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter 公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州恒巖儀器有限公司；YZ-1531-T多功能油炸鍋 廣東容聲電器股份有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 辣椒前處理與辣椒油的制備

1.4.1.1 辣椒前處理

取適量辣椒樣品于粉碎機(jī)中，粉碎1 min，粉碎后樣品過(guò)40目篩，取篩下物辣椒粉，將辣椒粉置于4 ℃冰箱待用。

1.4.1.2 辣椒油的制備

將大豆油加熱至170 ℃后，按辣椒粉∶大豆油為1∶4的比例，將大豆油澆于辣椒粉上，充分混勻，靜置于室溫后，用保鮮膜覆蓋，放于4 ℃冰箱待用。

1.4.2 NH2萃取柱的活化

將NH2萃取柱與萃取儀連接后，依次用5 mL甲醇、3 mL丙酮和3 mL正己烷活化柱。

1.4.3 辣椒油前處理

取適量辣椒油于離心管中，10000 r/min，4 ℃離心15 min。取2 g上清液，用2 mL正己烷稀釋待用。

將已經(jīng)稀釋的樣液加入已活化的柱中，控制流速≤1 mL/min，待稀釋液全部過(guò)柱后，加入5 mL正己烷淋洗，待正己烷過(guò)柱后，用真空泵把柱中的正己烷抽干凈，再用4 mL 90%甲醇-乙腈溶液進(jìn)行洗脫，待90%甲醇-乙腈溶液過(guò)柱后，用真空泵把柱中的90%甲醇-乙腈溶液抽干，收集洗脫液待用。

取全部洗脫液，用色譜級(jí)甲醇定容于10 mL容量瓶中，置于4 ℃冰箱中待用。

1.4.4 液相條件

色譜柱：Platisil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(水)為70∶30，流速：1 mL/min，柱溫箱溫度：30 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，進(jìn)樣量：10 μL[29]。

1.5 相關(guān)公式計(jì)算

1.5.1 辣椒堿含量計(jì)算

式中：w1為樣品中辣椒堿含量，g/kg；c1為由標(biāo)曲所計(jì)算的辣椒素含量，μg/mL；V為樣品定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。計(jì)算結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后三位。

1.5.2 二氫辣椒堿含量計(jì)算

式中：w2為樣品中二氫辣椒堿含量，g/kg；c2為由標(biāo)曲所計(jì)算的辣椒素含量，μg/mL；V為樣品定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。計(jì)算結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后三位。

1.5.3 辣椒素類(lèi)物質(zhì)總量計(jì)算

式中：w為樣品中辣椒素含量，g/kg；0.9為辣椒素與二氫辣椒素折算為辣椒素類(lèi)物質(zhì)總量的系數(shù)。計(jì)算結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后三位[30]。

1.6 工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)說(shuō)明

1.6.1 固相萃取條件的單因素實(shí)驗(yàn)

在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，稱(chēng)取2 g離心后的辣椒油，用稀釋劑正己烷用量分別為2，3，4，5，6，7，8 mL稀釋后，5 mL正己烷淋洗，5 mL甲醇洗脫；用5 mL正己烷稀釋?zhuān)? mL正己烷淋洗后，用洗脫劑種類(lèi)分別為甲醇、異丙醇、乙腈、乙酸乙酯和10%、30%、50%、70%、90%的甲醇-乙腈溶液2 mL洗脫；用5 mL正己烷稀釋?zhuān)? mL正己烷淋洗后，分別用體積為0.5，1，1.5，2，3，4，5 mL的甲醇溶液洗脫，研究這3個(gè)因素對(duì)辣椒油中辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取的影響，均設(shè)置3次重復(fù)。

1.6.2 辣椒素提取的正交實(shí)驗(yàn)

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 The factors and levels of orthogonal array design

由表1可知，以單因素實(shí)驗(yàn)為結(jié)果，選取稀釋劑用量、洗脫劑種類(lèi)和洗脫劑體積3個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)置4個(gè)水平，研究其對(duì)辣椒油中辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取的影響，重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和線(xiàn)性回歸方程

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制參照厲志偉[31]，以液相峰面積Y(mAU·s)為縱坐標(biāo)，物質(zhì)質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制得出的辣椒堿線(xiàn)性回歸方程為Y=5027.8X+5725.6，R2=0.999;二氫辣椒堿線(xiàn)性回歸方程為Y=4768.2X+1994.5，R2=0.9999。在樣品中辣椒堿和二氫辣椒堿濃度范圍為1～200 μg/mL時(shí)有良好的相關(guān)性。

2.2 辣椒堿和二氫辣椒堿標(biāo)品液相色譜檢測(cè)

辣椒堿和二氫辣椒堿的標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖見(jiàn)圖1。其中保留時(shí)間為13.1 min的物質(zhì)為辣椒堿，保留時(shí)間為18.5 min的物質(zhì)為二氫辣椒堿。

圖1 辣椒堿和二氫辣椒堿的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 The chromatogram of capsaicin and dihydrocapsaicin standard samples

2.3 辣椒與大豆油的最佳料液比實(shí)驗(yàn)

將大豆油加熱至170 ℃后，按辣椒粉∶大豆油為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7的比例，將油澆于辣椒粉上，充分混勻，靜置于室溫后，用保鮮膜覆蓋，放于4 ℃冰箱待用。

取出辣椒油，經(jīng)前處理后，使用液相得出的辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量見(jiàn)圖2。

圖2 不同料液比下辣椒油中辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量Fig.2 The content of capsaicinoids in chili oil under different solid-liquid ratios

由圖2可知，隨著料液比的增加，樣品中辣椒素類(lèi)物質(zhì)總量呈減少的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槔苯匪匾兹苡谟椭?，在料液比?∶3時(shí)就完全溶于油脂中，濃度達(dá)到最高，后續(xù)隨著料液比的增加，油脂中辣椒素總量不變，溶劑的量增加，相當(dāng)于稀釋了辣椒素類(lèi)物質(zhì)的含量，故而其含量呈逐漸減少趨勢(shì)。由于料液比為1∶3時(shí)，辣椒油的離心操作比較困難；料液比為1∶5時(shí)，油的用量增加，實(shí)驗(yàn)成本增加。故而本實(shí)驗(yàn)采用1∶4的料液比為最佳方案。

2.4 固相萃取條件的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 稀釋劑用量對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取的影響

在淋洗劑正己烷用量為5 mL，洗脫劑甲醇用量為5 mL的條件下，不同稀釋劑用量對(duì)辣椒油中辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取的影響見(jiàn)圖3。

圖3 稀釋劑用量對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取的影響Fig.3 The effect of diluent amount on the extraction of capsaicinoids

由圖3可知，在稀釋劑用量為2 mL時(shí)，辣椒素類(lèi)物質(zhì)的含量最多，為1.742 g/kg；而稀釋劑用量為3，4，5，6，7 mL時(shí)，對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量的影響不顯著。為了節(jié)省稀釋劑用量，選擇2，3，4，5 mL為固相萃取過(guò)程中稀釋劑的用量范圍。

2.4.2 洗脫劑種類(lèi)對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取的影響

在稀釋劑用量為2 mL，洗脫劑體積為5 mL時(shí)，洗脫劑種類(lèi)對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取的影響見(jiàn)圖4。

圖4 洗脫劑種類(lèi)對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取的影響Fig.4 The effect of eluent types on the extraction of capsaicinoids

在甲醇、異丙醇、乙腈和乙酸乙酯這4類(lèi)洗脫劑中，甲醇和異丙醇對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)的提取量要遠(yuǎn)大于乙腈和乙酸乙酯，由于辣椒素類(lèi)物質(zhì)普遍帶有羥基極性基團(tuán)，可以與甲醇和異丙醇這類(lèi)帶有羥基極性基團(tuán)的洗脫劑結(jié)合形成牢固的氫鍵，從而將辣椒素類(lèi)物質(zhì)從萃取柱上洗脫下來(lái)；而乙腈和乙酸乙酯由于不含有能與辣椒素類(lèi)物質(zhì)的羥基形成氫鍵的極性基團(tuán)，故而不能與辣椒素類(lèi)物質(zhì)緊密結(jié)合，也就無(wú)法很好地將辣椒素類(lèi)物質(zhì)從萃取柱上洗脫下來(lái)，又因?yàn)樽鳛闃O性溶劑，乙腈的極性比乙酸乙酯的極性大，所以乙腈的洗脫效率要大于乙酸乙酯。而在洗脫劑為10%、30%、50%、70%、90%甲醇-乙腈溶液的情況下，隨著洗脫劑中甲醇濃度的升高，辣椒素類(lèi)物質(zhì)的提取量總體呈上升趨勢(shì)，30%、50%、70%甲醇-乙腈溶液對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)的提取影響不顯著，選取提取量相對(duì)較高的30%甲醇-乙腈溶液、90%甲醇-乙腈溶液、甲醇和異丙醇為固相萃取過(guò)程中洗脫劑的種類(lèi)。

2.4.3 洗脫劑體積對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取的影響

在稀釋劑用量為2 mL，洗脫劑種類(lèi)為甲醇的條件下，洗脫劑體積對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取的影響見(jiàn)圖5。

圖5 洗脫劑體積對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取的影響Fig.5 The effect of eluent volume on extraction of capsaicinoids

在洗脫劑體積為0.5 mL時(shí)，辣椒素類(lèi)物質(zhì)的含量為0 g/kg，說(shuō)明此時(shí)洗脫劑用量太少，無(wú)法將辣椒素類(lèi)物質(zhì)從萃取柱上洗脫下來(lái)；在洗脫劑用量為1，1.5，2 mL時(shí)，隨著洗脫劑甲醇的體積增加，洗脫劑與萃取柱中辣椒素類(lèi)物質(zhì)的接觸體積與接觸時(shí)間逐漸增加，辣椒素類(lèi)物質(zhì)從萃取柱上轉(zhuǎn)移至洗脫液中的量也逐漸增加，在洗脫劑體積為2 mL時(shí)達(dá)到峰值。故而選取洗脫劑體積為2，3，4，5 mL為固相萃取過(guò)程中洗脫劑的體積。

2.5 固相萃取條件的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。固相萃取條件中影響辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取的各因素主次為C(洗脫劑用量，mL)>B(洗脫劑種類(lèi))>A(正己烷用量，mL)，因素C的F值與極差R均大于因素A與因素B的值，說(shuō)明洗脫劑用量對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取影響最大；F值與極差R最小的是因素A，說(shuō)明在影響辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取的因素中，稀釋劑正己烷的用量影響最小。根據(jù)各主次因素的最高水平，得出的最優(yōu)固相萃取提取辣椒素類(lèi)物質(zhì)的條件為A1B4C3，即稀釋劑正己烷用量為2 mL，洗脫劑種類(lèi)為90%甲醇-乙腈溶液，洗脫劑體積為4 mL為最優(yōu)固相萃取提取辣椒油中辣椒素的條件組合。

表2 正交實(shí)驗(yàn)提取優(yōu)化結(jié)果Table 2 The orthogonal experimental results for optimization of extraction process

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 The analysis of varlance of orthogonal experimental results

2.6 經(jīng)固相萃取后的樣品液相色譜檢測(cè)

經(jīng)固相萃取前處理后的辣椒油樣品的色譜圖見(jiàn)圖6。

圖6 經(jīng)固相萃取后的辣椒油樣品的色譜圖Fig.6 The chromatogram of chili oil samples after solid-phase extraction

由圖6可知，經(jīng)過(guò)固相萃取后的樣品沒(méi)有明顯的雜質(zhì)峰，說(shuō)明經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的固相萃取前處理方法能很好地將油脂類(lèi)雜質(zhì)與辣椒素分離開(kāi)來(lái)，增加辣椒素的檢測(cè)精度，減少色譜柱的損耗。

2.7 優(yōu)化后的固相萃取條件檢驗(yàn)

2.7.1 加標(biāo)回收率

用分析天平分別稱(chēng)取1 mg辣椒堿、1 mg二氫辣椒堿；10 mg辣椒堿、10 mg二氫辣椒堿；19 mg辣椒堿、19 mg二氫辣椒堿，分別加入2 g大豆油中，60 ℃水浴20 min，促進(jìn)辣椒素類(lèi)物質(zhì)的溶解，之后用渦旋儀混勻，將充分混勻的樣品經(jīng)固相萃取(2 mL正己烷稀釋?zhuān)? mL 90%甲醇-乙腈溶液洗脫)后，取全部洗脫液，用甲醇定容至100 mL，得低(辣椒堿和二氫辣椒堿均為10 μg/mL)、中(辣椒堿和二氫辣椒堿均為100 μg/mL)、高(辣椒堿和二氫辣椒堿均為190 μg/mL)3個(gè)濃度的分析物溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of standard recovery rate experiments

由表4可知，辣椒堿的平均回收率在84.3%～98.6%，二氫辣椒堿的回收率在87.3%～97.7%，且中質(zhì)量體積濃度與高質(zhì)量體積濃度的樣品的平均回收率要高于低質(zhì)量體積濃度的樣品，這可能是由于在低質(zhì)量體積濃度下，辣椒堿和二氫辣椒堿所稱(chēng)取質(zhì)量太少，稱(chēng)量工作的誤差較大，導(dǎo)致低質(zhì)量體積濃度的回收率較低。加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.1%～2.9%之間，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確性良好。

2.7.2 日內(nèi)精密度和日間精密度

取低、中、高3個(gè)濃度的分析物溶液，重復(fù)進(jìn)樣3次，連續(xù)3 d，測(cè)定其日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表5和表6。

表5 日內(nèi)精密度和日間精密度回收率Table 5 The recovery rate of intra-day precision and inter-day precision

表6 日內(nèi)精密度和日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 The results of intra-day precision and inter-day precision experiments

由表6可知，辣椒堿的日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD在0.2%～1.8%之間，日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD在0.2%～0.4%之間；二氫辣椒堿的日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD在0.2%～3.2%之間，日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果在0.2%～1.4%之間。說(shuō)明經(jīng)優(yōu)化的固相萃取工藝精密度高，穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

固相萃取法作為一種近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的樣品預(yù)處理技術(shù)，可以有效地將分析物和干擾組分分離，從而減少樣品的預(yù)處理過(guò)程，提高目標(biāo)分析物的回收率[32]。通過(guò)使用NH2萃取小柱的固相萃取技術(shù)對(duì)從富含油脂的樣品中提取分離辣椒素的前處理工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出洗脫劑體積對(duì)辣椒素的提取分離影響最大，其次是洗脫劑種類(lèi)和稀釋劑體積。優(yōu)化得到的固相萃取提取分離辣椒油中辣椒素的最佳工藝條件：在稀釋劑正己烷體積為2 mL，洗脫劑種類(lèi)為90%甲醇-乙腈溶液，洗脫劑體積為4 mL的條件下，辣椒素的提取率最高。通過(guò)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)固相萃取條件進(jìn)行檢驗(yàn)，辣椒素的回收率在84.3%～98.6%，RSD值在0.1%～2.9%之間；通過(guò)日內(nèi)精密度和日間精密度實(shí)驗(yàn)，其RSD值在0.2%～3.2%之間，說(shuō)明該法回收率高，精密度高，方法的穩(wěn)定性好。用優(yōu)化后的固相萃取技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行處理后，用HPLC檢測(cè)樣品，發(fā)現(xiàn)辣椒素物質(zhì)的峰形良好，不同的辣椒素物質(zhì)能很好地分離開(kāi)來(lái)，且沒(méi)有明顯的雜質(zhì)峰出現(xiàn)，說(shuō)明樣品經(jīng)前處理后，油脂雜質(zhì)能夠很好地與辣椒素分離開(kāi)來(lái)，這樣既提高了辣椒素的檢測(cè)精度，又大大減輕了油脂類(lèi)雜質(zhì)對(duì)色譜柱的損耗，可以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，降低實(shí)驗(yàn)成本。且對(duì)用HPLC檢測(cè)辣椒素和HPLC-MS研究辣椒油中辣椒素的降解機(jī)理提供一個(gè)切實(shí)可行的樣品前處理參考。