敖慧娟，石嘉琛，阿依木古麗·阿不都熱依木，喬自林，楊 琨

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

0 引言

MDCK細胞系由Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel 母曲架犬的腎臟中分離并培育，通常是以貼壁方式生長的上皮樣細胞.由于其病毒感染效率高、增殖快，不易變異，且適應(yīng)于無血清的生長條件，MDCK細胞系被公認是最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的3種細胞系之一[1-3].由于MDCK細胞本身具有較高的成瘤性，用其生產(chǎn)疫苗的安全性一直存在著爭議[4-5].近年來，喬自林等通過單細胞克隆培養(yǎng)和篩選,得到了數(shù)株低成瘤性的MDCK細胞株[6]，將其與實驗室已有的高成瘤性細胞株一并做高通量分析發(fā)現(xiàn)，某些經(jīng)典的腫瘤通路被靶基因激活，其中l(wèi)ncRNA MSTRG.1056.2直接調(diào)控ERBB3激活PI3K-Akt通路，促進腫瘤發(fā)生[7].為了保證疫苗的安全性，開發(fā)低成瘤性 MDCK 細胞系不僅可以減輕下游純化工藝的難度，還可以從根本上降低以其生產(chǎn)流感疫苗后的接種風(fēng)險.

FOXN2[8]蛋白被證實與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在某些類型的腫瘤中已經(jīng)觀察到FOXN2的異常表達.當FOXN2被下調(diào)時，在T細胞白血病中起抑癌作用，抑制肺癌的腫瘤發(fā)生和放射抗性，與放療或化學(xué)療法治療的成年成膠質(zhì)母細胞瘤的不良預(yù)后密切相關(guān).FOXN2的沉默可以抑制癌干細胞的間質(zhì)表型.異位表達FOXN2的表達顯著抑制了乳腺癌細胞的遷移和侵襲，并改變了EMT標記物(如E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白)的表達.此外，F(xiàn)OXN2可以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)SLUG表達，并且FOXN2的表達與乳腺癌組織中SLUG的表達呈負相關(guān).這些結(jié)果表明，F(xiàn)OXN2可能是EMT進展的重要因素，能夠促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲[9].檢測人非小細胞肺癌細胞 A549 和人胚肺成纖維細胞 MRC-5中FOXN2的mRNA 水平，發(fā)現(xiàn)其在A549細胞中的表達水平極顯著地低于 MRC-5細胞.在A549細胞中過表達FOXN2抑制了細胞的增殖，降低了細胞遷移侵襲能力[10].馬佳等人指出，F(xiàn)OXN2沉默可促進肺癌中細胞周期的重新分布和腫瘤發(fā)生[11]，并發(fā)現(xiàn)泛素連接酶β-Trcp可通過作用FOXN2第365位和第369位絲氨酸使FOXN2泛素化降解，進而抑制FOXN2的生物學(xué)效應(yīng)[12].

FOXN2作為一個抑癌基因，可以抑制肺癌A549細胞的生長增殖，可增強肺癌細胞的放療敏感性.但FOXN2對MDCK細胞成瘤性的影響尚不清楚，因此對不同成瘤性MDCK細胞中FOXN2差異表達及功能的研究具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 主要材料與器材

DMEM、MEM 、懸浮培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、0.25% 胰蛋白酶溶液(蘭州百靈生物技術(shù)有限公司 )，新生牛血清、胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)，臺盼藍，T25 細胞培養(yǎng)瓶( Corning )，TRIzolTMReagent(Thermo)；EVOM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞生物公司)，All-in-OneTMqPCR Mix-實時熒光定量PCR檢測試劑盒(GeneCopoeia,Inc.).

倒置相差顯微鏡 CK-41 (日本 Olympus)，細胞計數(shù)儀 IC1000 (Countstar)，移液槍 20～200 μL、1 mL Easypet (eppendorf)，液氮罐 YDS-100-200F (樂山市東亞機電工貿(mào)有限公司)，CO2細胞培養(yǎng)箱 311 (Thermo)，普通冰箱(2～8 ℃) SC387 、超低溫冰箱(-80 ℃) DW-86L386(青島海爾股份有限公司)，臺式低速離心機 TDL-80-2B (上海安亭科學(xué)儀器廠)，普通PCR擴增儀CLASSC K960-Thmal Cycler(Heal force)，實時定量基因擴增儀 CFX96TMReal-Time System(BIO-RAD).

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)

本實驗所選取的不同成瘤性細胞株是由課題組在前期實驗中馴化所得.前期裸鼠成瘤性實驗中發(fā)現(xiàn)：從ATCC引進的貼壁型MDCK-A和由其馴化所得懸浮型MDCK-B在裸鼠成瘤性實驗中的成瘤率均高達100%(10/10).而將MDCK-A通過有限稀釋法制備得到的貼壁型單克隆細胞株MDCK-C的裸鼠成瘤率為10%(1/10).貼壁型MRC-5細胞由蘭州民海生物工程有限公司贈送，其裸鼠成瘤率為0(0/10).因此，選用MRC-5作為陰性對照.將本實驗室已有的不同成瘤性MDCK細胞從液氮罐中取出，置于37 ℃溫水中直至完全融化,將懸浮型MDCK-B用無血清培養(yǎng)基置于37 ℃，5%CO2，轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床上培養(yǎng),并將貼壁型細胞MDCK-A,MDCK-C,用含10%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，對照組MRC-5細胞含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基,置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 細胞總RNA的提取

棄掉細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，并吸去殘余的PBS.加入TRIzol試劑，用槍尖反復(fù)用力吸打裂解細胞，室溫放置5 min以徹底解離蛋白復(fù)合體.將細胞與裂解液分裝在2個1.5 mL的已滅菌的無RNA酶PE管中，加入氯仿使其與TRIzol的體積比為1︰5.用力上下?lián)u20 s，室溫靜置3～5 min，12000×g4℃離心10 min，并小心吸取上層水相到新的已滅菌的無RNA酶PE管中，加入100%異丙醇到水相中，使得異丙醇與TRIzol的體積比為1︰2.室溫放置8～10 min以沉淀RNA.12000×g4℃離心5 min后，小心棄上清，防止將RNA沉淀一并棄掉.同1 mL75%的無水乙醇漂洗RNA沉淀，即無水乙醇與TRIzol的體積比為1︰1.將無水乙醇中的RNA以7500×g4℃離心5 min.小心吸去無水乙醇，并打開EP管的蓋子，室溫干燥RNA沉淀5～8 min，注意不可完全干燥.用DEPC水30～50 μL溶解RNA沉淀，用槍尖反復(fù)吹打以徹底增加RNA溶解.吸取1～3 μL RNA測量所提RNA樣品A260/A280的OD值.

1.2.3 Real Time PCR

在做Real Time PCR 之前，需要將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA.本實驗用的是艾科瑞生物公司的EVOM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒.

表1 去除gDNA試劑及反應(yīng)體系

將樣品混勻后進行短暫離心，再將樣品放入PCR 儀中42 ℃ 2 min.取出樣品放置在冰上加入發(fā)轉(zhuǎn)錄試劑.

表2 反轉(zhuǎn)錄試劑及反應(yīng)體系

混勻后短暫離心，再將樣品放入PCR 儀中37 ℃15 min，85 ℃5 s.以上過程就是將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的全過程.將得到的cDNA保存于-20 ℃試劑中.利用Primer 5.0軟件根據(jù)目的基因FOXN2( GeneID: 3344)和內(nèi)參基因GAPDH(GeneID: 2597)設(shè)計所需要的引物，見表3.

表3 基因引物序列信息

將引物系列送到甘肅一棵樹生物有限公司合成后，再用GeneCopoeia,Inc.的All-in-OneTMqPCR Mix-實時熒光定量PCR檢測試劑盒對目的基因進行檢測.其反應(yīng)體系見表4.

表4 熒光定量PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s;60 ℃退火20 s;72 ℃延伸15 s;95 ℃10 s到72 ℃15 s共40個循環(huán).溶解曲線分析為65 ℃10 s，95 ℃20 s.注意：每個樣品至少要做3個平行組.隨后搖勻，瞬時離心后，用BIO-RAD CFX96TMReal-Time System 分析目的基因在不同成瘤性MDCK 細胞中的表達量.2 h后可以根據(jù)反應(yīng)結(jié)果使用相對定量分析F=2-ΔΔCt進行數(shù)據(jù)分析.其計算方法為ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；-ΔΔCt=對照組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值；最后2-ΔΔCt反映各樣品相對對照組樣品目的基因的相對表達水平.利用GraphPad Prism 5作圖分析目的基因的表達量并作差異性分析.

2 結(jié)果

2.1 不同成瘤性細胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

將細胞培養(yǎng)48小時后置于顯微鏡下用4倍目鏡觀察細胞的生長狀況，如圖1所示.所培養(yǎng)細胞生長狀態(tài)良好，細胞輪廓清晰，懸浮細胞的活力高、結(jié)團少、均勻性好.其中MRC-5(圖A)成纖維狀生長；貼壁型MDCK-A(圖B)成上皮樣生長；懸浮型MDCK-B(圖C)呈圓形懸浮生長于無血清培養(yǎng)基中；MDCK-C(圖D)成上皮樣生長，可用于后續(xù)實驗.

A：陰性對照細胞MRC-5 B：貼壁型細胞MDCK-A C：懸浮型細胞MDCK-B D：單克隆貼壁型細胞MDCK-C

2.2 TRIzol Reagent 提取不同成瘤性細胞總RNA的純度分析

將提取的RNA進行純度分析發(fā)現(xiàn)，所有樣品OD值均在1.8～2.0之間，可用于后續(xù)實驗,具體結(jié)果如表5所示.

表5 樣品純度檢測結(jié)果

2.3 不同成瘤性細胞中FOXN2基因表達量的分析

RT-PCR檢測結(jié)果顯示,所設(shè)計的引物特異性高，定量結(jié)果重復(fù)性好(圖2).以MRC-5為對照組，利用GraphPad Prism 5作圖分析目的基因的表達量并作差異性分析發(fā)現(xiàn)： FOXN2在和MDCK-C細胞中的 P value< 0.0001，差異極顯著(圖3)，且在高成瘤性MDCK-A、MDCK-B與低成瘤性MDCK-C細胞之間的表達存在差異(圖4).這說明FOXN2在細胞內(nèi)的表達量可能與細胞成瘤性成正相關(guān)，可為進一步研究FOXN2在MDCK細胞成瘤性的作用機制提供理論參考.

圖2 引物特異性結(jié)果

圖3 FOXN2在不同成瘤性MDCK細胞中的表達結(jié)果

3 分析與討論

FOXN2被證實與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān).在研究宮頸癌組織和細胞系中發(fā)現(xiàn)lncRNA Wilms腫瘤1反義RNA(WT1-AS)顯著下調(diào).功能分析表明，WT1-AS的過表達顯著抑制宮頸癌細胞的生長、遷移和侵襲.熒光素酶報告基因分析的結(jié)果證實，miR-203a-5p是WT1-AS的直接靶標.而FOXN2被鑒定為miR-203a-5p的直接靶基因[13].在接受化學(xué)療法或放射療法的患者中，TCGA驗證隊列中的低FOXN2 mRNA和不良結(jié)局相關(guān)[14].為了鑒定拷貝數(shù)突變靶向的新型癌癥相關(guān)基因，進行T細胞急性淋巴細胞白血病(T-ALL)細胞系的基因組分析，識別了腫瘤抑制基因(TS)FBXO11和FOXN2.FBXO11，F(xiàn)OXN2和FOXN3的定量表達分析證實了已鑒定細胞系中轉(zhuǎn)錄水平的降低.生物信息學(xué)分析顯示，F(xiàn)OXN2和FOXN3與同源盒基因ZHX1同時減少.實驗證明，F(xiàn)OXN2和FOXN3都能直接激活ZHX1的轉(zhuǎn)錄[15].但FOXN2在MDCK細胞成瘤性的研究中少有報道.在本研究中，我們挑選了前期實驗室凍存的不同成瘤性細胞，旨在探究FOXN2在不同成瘤性細胞中的表達量關(guān)系，進而為利用基因工程手段構(gòu)建穩(wěn)定的低成瘤細胞系奠定基礎(chǔ).結(jié)果表明，F(xiàn)OXN2在高成瘤性MDCK-A和MDCK-B與低成瘤性細胞株MDCK-C之間的表達量具有差異性(圖4).這由MDCK細胞群的多樣性擴展到了其成瘤性蛋白表達的差異，并為進一步開展FOXN2在MDCK細胞中的成瘤性機制研究提供了參考信息.

圖4 FOXN2在不同成瘤性 MDCK細胞中的差異表達

4 結(jié)論

本研究采用前期裸鼠成瘤性實驗中的不同成瘤性MDCK 細胞為研究原材料，結(jié)果表明FOXN2在高成瘤性MDCK細胞株MDCK-A和MDCK-B中的表達量遠高于低成瘤性細胞株MDCK-C.這由MDCK細胞群的多樣性擴展到了其成瘤性蛋白表達的差異，并為進一步開展FOXN2在MDCK細胞中的成瘤性機制的研究提供了參考信息.另外，本研究結(jié)果將來可用于表征不同MDCK細胞的克隆及馴化，為研究MDCK細胞腫瘤生物學(xué)特征，以及評估MDCK細胞作為疫苗生產(chǎn)的細胞基質(zhì)等提供基礎(chǔ).