張旻軼 樓毅云 傅 萍#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 浙江 杭州 310053

2 浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

3 杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)大多為早期妊娠丟失，是孕期常見現(xiàn)象，中醫(yī)學(xué)將本病歸之于“墮胎”“滑胎”等范疇。本研究在前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，從腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)入手，觀察磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）信號通路的相關(guān)分子血清和糖皮質(zhì)激素激酶1（SGK1）、SGK2、SGK3以及子宮內(nèi)膜蛻膜化標(biāo)志分子泌乳素（PRL）在腎虛型復(fù)發(fā)性自然者蛻膜組織中的mRNA的表達(dá)，以及應(yīng)用滑胎安胎協(xié)定方后蛻膜細(xì)胞中SGK1和PRL的相對表達(dá)，以探討滑胎安胎協(xié)定方對妊娠早期子宮內(nèi)膜蛻膜化的進(jìn)程的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：經(jīng)杭州市中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和納入標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，選取2013年1月～2018年12月期間在杭州市中醫(yī)院就診的妊娠早期（妊娠12周之前）者為研究對象，其中正常早期妊娠要求人工流產(chǎn)者26例作為正常對照組，年齡21～43歲，平均28.69±1.39歲；人工流產(chǎn)次數(shù)0～2次，平均0.20±0.09次；孕周6～10周，平均8.04±0.23周。腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)26例為實(shí)驗(yàn)組，年齡19～37歲，平均27.96±0.89歲；自然流產(chǎn)次數(shù)2～3次，平均2.00±0.11次；孕周7～11周，平均8.50±0.26周。兩組資料比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

1.2 蛻膜收集及處理：收集流產(chǎn)者子宮蛻膜組織，50ml離心管，預(yù)先分裝生理鹽水，按上述納入和排除標(biāo)準(zhǔn)分組收集對照組和實(shí)驗(yàn)組蛻膜組織，將清宮術(shù)中取出的蛻膜組織放入生理鹽水中，置于冰盒內(nèi)，術(shù)后1小時(shí)內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。生理鹽水充分洗滌蛻膜組織，盡量除去血塊及血細(xì)胞，吸水紙吸凈蛻膜組織表面生理鹽水，剪碎后凍存管分裝，液氮中凍存1小時(shí)，在-80℃冰箱凍存。

1.3 藥物制備：受試藥物制備按本研究組前期臨床研究方案制備[3]。精密稱取菟絲子、覆盆子、桑寄生、苧麻根各200g，阿膠、當(dāng)歸、杭白芍各150g（滑胎安胎協(xié)定方），碾碎制成粗粉，混合后回流提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，之后濾過，濾液減壓回收定容，至250ml，滅菌分裝備用；取1ml滑胎安胎協(xié)定方混合提取物（2g/ml），加入培養(yǎng)液后配制母液（30mg/ml），EP管分裝，放于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛻膜細(xì)胞培養(yǎng)：無菌條件下取得正常妊娠早期人流術(shù)后蛻膜組織，放入1%雙抗的培養(yǎng)基，用消毒的眼科剪將蛻膜組織剪碎，消化過濾，1000rpm離心，裂解后置于5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。用上述制備的滑胎安胎協(xié)定方受試藥物處理蛻膜細(xì)胞，設(shè)為中藥組，培養(yǎng)過夜，并設(shè)同期對照組。

1.5 Real-time PCR法檢測PI3K信號通路相關(guān)分子mRNA的表達(dá)：Trizol一步法提取蛻膜組織和培養(yǎng)后蛻膜細(xì)胞的總RNA，總RNA濃度測定后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法測定蛻膜組織中SGK1、SGK2、SGK3、PRL、PKD1、CD44和CD44v6的mRNA表達(dá)水平，以及測定蛻膜細(xì)胞對照組和中藥處理組中SGK1和PRL的mRNA表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS16.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±s)表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮蛻膜組織中PI3K信號通路相關(guān)分子的mRNA表達(dá)：對納入本研究的26例正常早期妊娠者（對照組）和同期26例腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者（實(shí)驗(yàn)組）的子宮蛻膜組織中SGK1 mRNA水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組蛻膜組織中的SGK1 mRNA表達(dá)較對照組下降（P＜0.01），本研究印證了我們前期的研究結(jié)果[3]。見圖1。

圖1 正常對照組與實(shí)驗(yàn)組蛻膜組織中SGK1 mRNA表達(dá)

圖2 正常對照組與實(shí)驗(yàn)組蛻膜組織中PI3K信號通路上相關(guān)分子的mRNA表達(dá)

以GAPDH為內(nèi)參，對SGK1的另兩個(gè)亞型SGK2和SGK3、PRL、PDK1、CD44及CD44v6在正常對照組和實(shí)驗(yàn)組蛻膜組織中的表達(dá)進(jìn)行Real time PCR分析，SGK2和SGK3這兩個(gè)SGK的異構(gòu)酶在實(shí)驗(yàn)組蛻膜組織中的mRNA表達(dá)低于同期正常對照組（P＜0.01)；子宮內(nèi)膜蛻膜化標(biāo)志分子PRL在實(shí)驗(yàn)組蛻膜組織中的相對表達(dá)量亦低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)。見圖2。

2.2 滑胎安胎協(xié)定方對蛻膜細(xì)胞中SGK1、PRL mRNA表達(dá)的影響：以滑胎安胎協(xié)定方處理蛻膜細(xì)胞，本研究應(yīng)用Real time PCR分析對照組以及中藥組蛻膜細(xì)胞中SGK1和PRL的表達(dá)。SGK1在滑胎安胎協(xié)定方處理組中的相對表達(dá)量高于對照組（P＜0.05)。子宮內(nèi)膜蛻膜化標(biāo)志分子PRL在中藥組蛻膜細(xì)胞中的相對表達(dá)量亦顯著高于對照組（P＜0.01)。見圖3。

圖3 滑胎安胎協(xié)定方對蛻膜細(xì)胞中SGK1、PRL mRNA表達(dá)的影響

3 討論

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)病因復(fù)雜，目前胚胎染色體核型異常是公認(rèn)病因，但隨著自然流產(chǎn)次數(shù)的增加，胚胎染色體異常的機(jī)率下降，提示其他主導(dǎo)機(jī)制的存在，如解剖學(xué)、免疫學(xué)、內(nèi)分泌、微生物學(xué)以及血栓性疾病等[4-5]。中醫(yī)學(xué)對本病的認(rèn)識由來已久，《諸病源候論》列有“妊娠漏候”“妊娠胎動候”，指出“妊娠而恒腰痛者”，為“喜墮胎”之候，提示腎與胞胎的關(guān)系。胎者泰然蓬生，若腎氣乏，則沖任不固，胞胎難系[6]。因此，本研究選取腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)作為研究對象。

本研究所用滑胎安胎協(xié)定方（菟絲子、覆盆子、桑寄生、苧麻根、阿膠、當(dāng)歸、杭白芍）系名老中醫(yī)臨證經(jīng)驗(yàn)方，方中菟絲子滋補(bǔ)肝腎、固精安胎，是為君藥；覆盆子添精補(bǔ)髓、疏利腎氣，是為臣藥；桑寄生益肝腎祛風(fēng)濕，苧麻根清熱涼血止血，阿膠養(yǎng)血補(bǔ)血滋陰，杭白芍養(yǎng)血和營柔肝。全方溫而不燥，補(bǔ)而不滯，共同起到益腎安胎的作用。根據(jù)藥物組成的性味功效分析，滑胎安胎協(xié)定方對腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)有治療效應(yīng)。

本研究結(jié)果表明腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)者子宮蛻膜中PI3K信號通路上相關(guān)分子SGK1、SGK2、SGK3、PRL的mRNA表達(dá)顯著降低，腎虛型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)與子宮蛻膜中PI3K-SGK1通路的下調(diào)相關(guān)?；グ蔡f(xié)定方提高蛻膜細(xì)胞中SGK1、PRL的表達(dá)，可通過調(diào)節(jié)PI3K信號通路，影響子宮內(nèi)膜蛻膜化的正常進(jìn)行，維持妊娠的正常進(jìn)程，改善妊娠結(jié)局。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步闡述妊娠早期PI3K及其信號通路上相關(guān)分子的表達(dá)影響妊娠進(jìn)程的機(jī)理，為中醫(yī)補(bǔ)腎治療提供分子理論基礎(chǔ)，為中醫(yī)藥防治復(fù)發(fā)性流產(chǎn)研究提供新的思路。