杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷加重，甚至發(fā)生不可逆行損傷的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷，亦稱為心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷，主要由能量代謝、氧化應(yīng)激、鈣離子超載等因素所致。自20世紀(jì)60年代，德國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)銀杏葉中含有治療心腦血管疾病的藥效成分以來，越來越多的研究表明，銀杏葉提取物在心腦血管疾病的治療中具有很好的藥理活性[1-2]。銀杏葉片是臨床常用的心腦血管保護(hù)制劑，具有活血化瘀通絡(luò)之功效，本文在細(xì)胞水平研究其對(duì)缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，以評(píng)估其在臨床心血管急癥中的治療價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料：Annexin V-FITC/PI檢測(cè)試劑盒（聯(lián)科生物），PBS緩沖液（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）。流式細(xì)胞儀（BD，F(xiàn)ACSCanto）；酶標(biāo)儀（賽默飛，Multiskan FC）。心肌細(xì)胞（H9C2細(xì)胞）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，用含有10%熱滅活FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基置37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法：分述如下。

1.2.1 細(xì)胞存活率和線粒體氧呼吸率實(shí)驗(yàn)：H9C2細(xì)胞接種于96孔板，10%FBS高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（Gibco）24hrs后，加入含有大銀杏葉片（稀釋1/50，1/100,1/200）無糖無血清培養(yǎng)液（Gibco），放入缺氧小室和缺氧箱（95%N2/5%CO2）培養(yǎng)22h后全培養(yǎng)基復(fù)氧2h，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照和模型組。采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率；采用液相氧呼吸儀測(cè)定細(xì)胞氧呼吸率。

1.2.2 細(xì)胞凋亡監(jiān)測(cè)：H9C2細(xì)胞接種于6孔板，10%FBS高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（Gibco）24hrs后，加入含有大銀杏葉片（稀釋1/50，1/100,1/200）無糖無血清培養(yǎng)液（Gibco），放入缺氧小室和缺氧箱（95%N2/5%CO2）培養(yǎng)22 h后全培養(yǎng)基復(fù)氧2h，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照和模型組。復(fù)氧后收集細(xì)胞并用預(yù)冷的PBS潤洗兩遍，再加入流式緩沖液重懸，然后加入Annexin V-FITC和PI兩種試劑在37℃下避光孵育15分鐘后染色10分鐘，再采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖，所有數(shù)據(jù)均以(Mean±SD)表示，組間比較采用One-way ANOVA分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀杏葉片增加缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的存活率及線粒體氧消耗量：MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞存活率下降到60%左右，加入銀杏葉片后能顯著提升細(xì)胞存活率（P＜0.05），而且在1/50～1/200范圍內(nèi)，隨著銀杏葉片濃度升高，心肌細(xì)胞存活率有升高趨勢(shì)。見圖1。

線粒體氧呼吸率試驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞線粒體氧消耗量顯著下降，銀杏葉1/50劑量組顯著提升缺氧復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞線粒體氧消耗量（P＜0.05）。見圖2。

圖1 銀杏葉片增加缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的存活率(n=6)

圖2 銀杏葉片增加缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞線粒體氧消耗量(n=6)

2.2 銀杏葉片抑制缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞凋亡：流式細(xì)胞檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示，銀杏葉1/50、1/100劑量組顯著抑制缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。見圖3。

圖3 銀杏葉片抑制缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞凋亡(n=3)

3 討論

隨著冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、溶栓術(shù)等急性心肌梗死治療技術(shù)的推廣，心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷已經(jīng)成為影響急性心肌梗死患者治療效果與預(yù)后的重要研究指標(biāo)。心肌缺血再灌注損傷的主要原因有能量代謝障礙、過氧化損傷、鈣超載等，其中氧自由基生成導(dǎo)致的過氧化損傷是造成心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)[3,4]。因此，急性心肌梗死治療中除了盡快恢復(fù)缺血組織的血流灌注外，應(yīng)重點(diǎn)考慮對(duì)缺血時(shí)間較長(zhǎng)的心肌組織進(jìn)行保護(hù)，以減少再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。

基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示，銀杏葉活性成分在心血管疾病的治療中表現(xiàn)出了很好的療效[5-6]，Wang Z[7]等人通過心肌梗死模型的代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示，銀杏葉提取物可調(diào)節(jié)能量代謝，具有抗炎、抗氧化、降脂等多種功效；Zhang[8]等人對(duì)銀杏葉提取物EGb761進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其能通過調(diào)節(jié)ATM通路和細(xì)胞凋亡來保護(hù)缺氧/復(fù)氧損傷的微血管內(nèi)皮細(xì)胞。本次研究以已上市的藥物銀杏葉片為對(duì)象，采用缺氧復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞為模型。結(jié)果顯示，加入銀杏葉片保護(hù)后再對(duì)缺氧心肌細(xì)胞進(jìn)行復(fù)氧，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示心肌細(xì)胞存活率顯著升高，而流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果則顯示心肌細(xì)胞凋亡率顯著下降，可見，銀杏葉片能有效保護(hù)心肌細(xì)胞，抑制心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后死亡。

心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后會(huì)導(dǎo)致線粒體內(nèi)鈣超載及過氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致線粒體膜破裂，線粒體膜間的促凋亡因子大量釋放，并最終激活心肌細(xì)胞凋亡通路，促使大量心肌細(xì)胞損傷[9]。我們的線粒體氧呼吸率試驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞線粒體氧消耗量顯著下降，銀杏葉片則可顯著提升缺氧復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞線粒體氧消耗量，說明銀杏葉片對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的線粒體具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過保護(hù)線粒體來抑制心肌細(xì)胞凋亡。

總之，我們通過初步研究證實(shí)銀杏葉片對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，能有效抑制缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與其對(duì)線粒體的保護(hù)作用有關(guān)。至于銀杏葉片對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞保護(hù)的具體分子機(jī)制及動(dòng)物水平驗(yàn)證，還有待進(jìn)一步研究。