杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

在缺血基礎上恢復血流后組織損傷加重，甚至發(fā)生不可逆行損傷的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷，亦稱為心肌細胞缺氧復氧損傷，主要由能量代謝、氧化應激、鈣離子超載等因素所致。自20世紀60年代，德國科學家發(fā)現(xiàn)銀杏葉中含有治療心腦血管疾病的藥效成分以來，越來越多的研究表明，銀杏葉提取物在心腦血管疾病的治療中具有很好的藥理活性[1-2]。銀杏葉片是臨床常用的心腦血管保護制劑，具有活血化瘀通絡之功效，本文在細胞水平研究其對缺氧復氧損傷心肌細胞的保護作用，以評估其在臨床心血管急癥中的治療價值。

1 材料與方法

1.1 材料：Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒（聯(lián)科生物），PBS緩沖液（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）。流式細胞儀（BD，F(xiàn)ACSCanto）；酶標儀（賽默飛，Multiskan FC）。心肌細胞（H9C2細胞）購自中國科學院上海細胞庫，用含有10%熱滅活FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基置37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試驗方法：分述如下。

1.2.1 細胞存活率和線粒體氧呼吸率實驗：H9C2細胞接種于96孔板，10%FBS高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（Gibco）24hrs后，加入含有大銀杏葉片（稀釋1/50，1/100,1/200）無糖無血清培養(yǎng)液（Gibco），放入缺氧小室和缺氧箱（95%N2/5%CO2）培養(yǎng)22h后全培養(yǎng)基復氧2h，同時設正常對照和模型組。采用MTT法測定細胞存活率；采用液相氧呼吸儀測定細胞氧呼吸率。

1.2.2 細胞凋亡監(jiān)測：H9C2細胞接種于6孔板，10%FBS高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（Gibco）24hrs后，加入含有大銀杏葉片（稀釋1/50，1/100,1/200）無糖無血清培養(yǎng)液（Gibco），放入缺氧小室和缺氧箱（95%N2/5%CO2）培養(yǎng)22 h后全培養(yǎng)基復氧2h，同時設正常對照和模型組。復氧后收集細胞并用預冷的PBS潤洗兩遍，再加入流式緩沖液重懸，然后加入Annexin V-FITC和PI兩種試劑在37℃下避光孵育15分鐘后染色10分鐘，再采用流式細胞儀檢測細胞熒光。

1.3 統(tǒng)計學處理：采用GraphPad Prism 6.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，所有數(shù)據(jù)均以(Mean±SD)表示，組間比較采用One-way ANOVA分析，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 銀杏葉片增加缺氧復氧損傷心肌細胞的存活率及線粒體氧消耗量：MTT檢測結果顯示，缺氧復氧損傷后心肌細胞存活率下降到60%左右，加入銀杏葉片后能顯著提升細胞存活率（P＜0.05），而且在1/50～1/200范圍內(nèi)，隨著銀杏葉片濃度升高，心肌細胞存活率有升高趨勢。見圖1。

線粒體氧呼吸率試驗結果顯示，缺氧復氧損傷后心肌細胞線粒體氧消耗量顯著下降，銀杏葉1/50劑量組顯著提升缺氧復氧損傷后心肌細胞線粒體氧消耗量（P＜0.05）。見圖2。

圖1 銀杏葉片增加缺氧復氧損傷心肌細胞的存活率(n=6)

圖2 銀杏葉片增加缺氧復氧損傷心肌細胞線粒體氧消耗量(n=6)

2.2 銀杏葉片抑制缺氧復氧損傷心肌細胞凋亡：流式細胞檢測凋亡結果顯示，銀杏葉1/50、1/100劑量組顯著抑制缺氧復氧損傷心肌細胞凋亡（P＜0.05）。見圖3。

圖3 銀杏葉片抑制缺氧復氧損傷心肌細胞凋亡(n=3)

3 討論

隨著冠狀動脈搭橋術、溶栓術等急性心肌梗死治療技術的推廣，心肌細胞缺血再灌注損傷已經(jīng)成為影響急性心肌梗死患者治療效果與預后的重要研究指標。心肌缺血再灌注損傷的主要原因有能量代謝障礙、過氧化損傷、鈣超載等，其中氧自由基生成導致的過氧化損傷是造成心肌細胞缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)[3,4]。因此，急性心肌梗死治療中除了盡快恢復缺血組織的血流灌注外，應重點考慮對缺血時間較長的心肌組織進行保護，以減少再灌注導致的心肌細胞凋亡。

基礎研究結果顯示，銀杏葉活性成分在心血管疾病的治療中表現(xiàn)出了很好的療效[5-6]，Wang Z[7]等人通過心肌梗死模型的代謝組學研究結果顯示，銀杏葉提取物可調(diào)節(jié)能量代謝，具有抗炎、抗氧化、降脂等多種功效；Zhang[8]等人對銀杏葉提取物EGb761進行觀察，發(fā)現(xiàn)其能通過調(diào)節(jié)ATM通路和細胞凋亡來保護缺氧/復氧損傷的微血管內(nèi)皮細胞。本次研究以已上市的藥物銀杏葉片為對象，采用缺氧復氧H9C2心肌細胞為模型。結果顯示，加入銀杏葉片保護后再對缺氧心肌細胞進行復氧，MTT實驗檢測結果顯示心肌細胞存活率顯著升高，而流式細胞檢測結果則顯示心肌細胞凋亡率顯著下降，可見，銀杏葉片能有效保護心肌細胞，抑制心肌細胞缺氧復氧后死亡。

心肌細胞缺氧復氧后會導致線粒體內(nèi)鈣超載及過氧化應激，最終導致線粒體膜破裂，線粒體膜間的促凋亡因子大量釋放，并最終激活心肌細胞凋亡通路，促使大量心肌細胞損傷[9]。我們的線粒體氧呼吸率試驗結果顯示，缺氧復氧損傷后心肌細胞線粒體氧消耗量顯著下降，銀杏葉片則可顯著提升缺氧復氧損傷后心肌細胞線粒體氧消耗量，說明銀杏葉片對缺氧復氧心肌細胞的線粒體具有保護作用，其機制可能通過保護線粒體來抑制心肌細胞凋亡。

總之，我們通過初步研究證實銀杏葉片對缺氧復氧心肌細胞具有保護作用，能有效抑制缺氧復氧后心肌細胞凋亡，其作用機制可能與其對線粒體的保護作用有關。至于銀杏葉片對缺氧復氧心肌細胞保護的具體分子機制及動物水平驗證，還有待進一步研究。