范冰峰，趙向遠(yuǎn)，韓玉萍，李文，李曉霞，許保增

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟動物分子生物學(xué)重點實驗室，吉林 長春 130112）

卵母細(xì)胞成熟和排卵過程對于雌性動物的生殖生理十分重要，顆粒細(xì)胞利用多種細(xì)胞之間的相互作用和信號調(diào)節(jié)，將這2 個過程緊密聯(lián)系起來[1]。在雌性哺乳動物中，卵母細(xì)胞被單層扁平的顆粒細(xì)胞包裹，卵母細(xì)胞停滯在第一次減數(shù)分裂前期的雙線期。隨著卵泡的不斷發(fā)育，顆粒細(xì)胞由扁平狀變?yōu)橹鶢睿蓡螌幼優(yōu)槎鄬?。在卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）的作用下，卵泡腔形成，卵泡成熟。在黃體生成素（luteinizing hormone，LH）峰作用下，卵丘擴展、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)、卵泡破裂，以實現(xiàn)排卵。顆粒細(xì)胞依據(jù)解剖學(xué)結(jié)構(gòu)分為壁層顆粒細(xì)胞（mural granulose cell，MGC）和卵丘細(xì)胞（cumulus cell，CC）[2]，壁層顆粒細(xì)胞參與細(xì)胞分化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]，卵丘細(xì)胞參與細(xì)胞增殖和代謝[4]。卵丘細(xì)胞 通過縫隙連接（gap junction，GJ）與卵母細(xì)胞形成卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus-oocyte complexes，COCs）[5]，研究卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間的直接交流或旁分泌作用對排卵過程的影響，有助于人們理解生殖細(xì)胞發(fā)育的機理。本文綜述了顆粒細(xì)胞對卵母細(xì)胞成熟的影響、顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的互作對排卵過程的影響以及卵丘擴展對卵母細(xì)胞成熟和排卵的影響，以期為哺乳動物卵母細(xì)胞體外成熟體系的建立，以及排卵機理的研究提供新的思路。

1 顆粒細(xì)胞對卵母細(xì)胞成熟的影響

1.1 顆粒細(xì)胞為卵母細(xì)胞提供能量

卵母細(xì)胞中的葡萄糖不能通過糖酵解直接分解供能，卵丘細(xì)胞的胞質(zhì)突起穿過透明帶與卵母細(xì)胞直接接觸，而末端通過縫隙鏈接卵母細(xì)胞質(zhì)膜，為卵母細(xì)胞提供營養(yǎng)代謝物質(zhì)[6]。卵母細(xì)胞通過縫隙鏈接獲得氨基酸、核苷酸、谷胱甘肽和糖代謝產(chǎn)物[7]等物質(zhì)，為卵母細(xì)胞提供能量[8]。Herrick 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，山羊COCs的糖酵解速率是氧化磷酸化速率的3 倍，在卵母細(xì)胞成熟過程中葡萄糖是COCs 的關(guān)鍵能量代謝物，糖酵解是關(guān)鍵的能量代謝途徑。由于卵母細(xì)胞磷酸果糖激酶和乳酸脫氫酶活性低，卵母細(xì)胞的糖酵解效率僅為COCs 的50%，葡萄糖主要由卵丘細(xì)胞糖酵解產(chǎn)生丙酮酸和乳酸，轉(zhuǎn)移至卵母細(xì)胞線粒體中，為其分解供能[4]。卵母細(xì)胞又通過上調(diào)卵丘細(xì)胞中糖酵解基因的表達(dá)來保證其丙酮酸的供應(yīng)[10]。通過對醛糖還原酶和山梨醇脫氫酶在卵巢顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中的表達(dá)定位分析，表明葡萄糖在顆粒細(xì)胞中還原脫氫形成的山梨醇，會被卵母細(xì)胞間接合成果糖供能[11]。卵母細(xì)胞成熟主要由顆粒細(xì)胞提供能量物質(zhì)。

1.2 顆粒細(xì)胞維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯

在生長卵泡中，顆粒細(xì)胞分泌類固醇和肽類激素來調(diào)節(jié)發(fā)情周期，卵母細(xì)胞積累母體所需的mRNA和蛋白質(zhì)，為卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、成熟和胚胎發(fā)育做準(zhǔn)備。腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和環(huán)磷鳥嘌呤核苷（cyclic guanosinc monophosphate，cGMP）這些信號分子不僅可以為卵母細(xì)胞提供能量，同時對于恢復(fù)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯十分重要。在卵母細(xì)胞周期性調(diào)節(jié)過程中，成熟促進(jìn)因子（maturation promoting factor，MPF）直接或間接地調(diào)節(jié) cAMP-PKA 信號通路。高水平的cAMP 通過激活卵丘細(xì)胞中腺苷酸環(huán)化酶，維持細(xì)胞周期蛋白的MPF 處于無活性狀態(tài)，使其無法恢復(fù)減數(shù)分裂[12]。cGMP 是由跨膜鳥苷酸環(huán)化酶利鈉肽受體2（natriuretic Peptide Receptor 2，NPR 2）產(chǎn)生的，它存在于顆粒細(xì)胞中，但不存在于卵母細(xì)胞中，在維持減數(shù)分裂停滯起著重要作用。排卵前期，處于顆粒細(xì)胞的cGMP 通過縫隙鏈接擴散到卵母細(xì)胞，使cGMP 的拮抗劑cAMP 磷酸二酯酶失活，從而導(dǎo)致高水平的 cAMP 無法降解，抑制減數(shù)分裂進(jìn)程[13]。即使是在成熟的最后幾小時去除卵丘細(xì)胞層，卵母細(xì)胞成熟并發(fā)育成正常胚胎的能力也會受到嚴(yán)重?fù)p害[14]。

1.3 顆粒細(xì)胞促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)

卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)需要顆粒細(xì)胞的誘導(dǎo)，主要有3 個因素：①LH 峰誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶3/1（MAPK 3/1）活化[15]，同時降低壁層顆粒細(xì)胞中 C 型利鈉肽（C-type natriuretic peptide，NPCC）的濃度，導(dǎo)致成熟抑制因子 cAMP 水解，減數(shù)分裂恢復(fù)；②縫隙連接對減數(shù)分裂的恢復(fù)作用，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠卵母細(xì)胞縫隙鏈接被破壞時，阻滯減數(shù)分裂的信號則無法進(jìn)入卵母細(xì)胞，減數(shù)分裂恢復(fù)[16]；③LH受體（LH receptor，LHR）是G 蛋白偶聯(lián)受體家族成員，在卵巢中介導(dǎo)LH 峰對細(xì)胞的作用。LHR 在卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，而在顆粒細(xì)胞大量表達(dá)，所以顆粒細(xì)胞在傳遞LH 排卵信號中起著橋梁作用[8]。收集COC并進(jìn)行體外培養(yǎng)時，卵母細(xì)胞發(fā)展到具有受精和發(fā)育能力的MII 期，在對裸卵體外培養(yǎng)時，卵母細(xì)胞成熟率和受精率均低于COC 的水平，這表明顆粒細(xì)胞對于促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)起重要作用[17]。

2 顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的互作對排卵過程的影響

2.1 顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞分泌的信號因子和代謝產(chǎn)物對排卵的影響

卵母細(xì)胞通過分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（bone morphogenetic protein 15，BMP 15）和生長分化因子 9（growth differentiation factor 9，GDF 9）調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞基因的表達(dá)。這些細(xì)胞因子通過抑制編碼LHR 的基因，使得排卵前卵丘細(xì)胞表達(dá)的 LHR 蛋白水平降低[18]，來抑制促性腺激素誘導(dǎo)孕酮的合成，從而調(diào)控卵泡的發(fā)育和排卵。同時，GDF 9 和BMP 15 激活了卵丘特異性代謝的關(guān)鍵基因表達(dá)，如糖酵解酶[19]和膽固醇生物合成酶[20]，它們是卵母細(xì)胞活力和功能的重要介質(zhì)。GDF 9 和BMP 15 通過TGF- 超家族受體發(fā)出信號激活細(xì)胞內(nèi) Smads 途徑[21]。Pangas 等[22]通過敲除 Smad 4 的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞黃體化提前，孕酮水平上升，最終導(dǎo)致卵巢功能早衰。從COCs 中去除卵母細(xì)胞或用GDF 9/BMP 15 的拮抗劑處理會導(dǎo)致顆粒細(xì)胞異常誘導(dǎo)和卵丘特異性基因表達(dá)的丟失[23]。Qin 等[24]通過建立BMP 15 基因敲除模型豬，轉(zhuǎn)錄組分析顯示BMP 15 影響顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞發(fā)育，包括抑制細(xì)胞的增殖分化和卵泡刺激素受體表達(dá)，導(dǎo)致雌二醇產(chǎn)生的減少，異常卵泡數(shù)量增加，有腔卵泡異常增大，導(dǎo)致排卵障礙和生殖激素紊亂。

Yu 等[25]建立了特異性敲除DNA 損傷結(jié)合蛋白1（damage specific DNA binding protein 1，DDB 1）和DDB 1-CUL 4 相關(guān)因子 1（DDB1-CUL 4 associated factor 1，DCAF 1）的小鼠動物模型，發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞內(nèi)的DDB 1/DCAF 1 是卵丘擴張和排卵相關(guān)基因表達(dá)所必需的。其潛在的機制是DDB 1/DCAF 1 缺失損害了編碼卵母細(xì)胞的旁分泌因子GDF 9、BMP 15 和成纖維細(xì)胞生長因子 8（fibroblast growth factor 8，F(xiàn)GF 8）基因的表達(dá)，未能激活周圍卵丘細(xì)胞中的 TGF- 信號，影響了COCs 對LH 峰排卵信號的反饋，進(jìn)而導(dǎo)致排卵率顯著下降。Andreu-Vieyra 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，若卵母細(xì)胞特異性缺失MⅡ組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默，卵泡破裂受阻，排卵過程被阻斷，因此通過卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的信號交流情況，可以判斷成熟的卵母細(xì)胞能否順利排出。干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）是一種表達(dá)于顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞因子，通過與卵母細(xì)胞上的酪氨酸激酶受體C-Kit結(jié)合，激活磷脂酰肌醇3 磷酸信號通路，促進(jìn)了卵母細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育并觸發(fā)排卵[27]。Salmassi等[28]通過研究卵泡成熟、排卵、著床和妊娠過程中血清SCF 水平在月經(jīng)周期中的變化，發(fā)現(xiàn)SCF可能是卵泡成熟的一個潛在的標(biāo)志物，血清中SCF 水平反映了卵泡成熟程度并有助于預(yù)測卵母細(xì)胞的成熟度。Tan等[29]研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞中的卵母細(xì)胞水平與卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能呈正相關(guān)，隨著SCF 的水平提高，卵泡的排卵能力有顯著提高。

Noch 信號是一條進(jìn)化保守的途徑，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。Notch 信號通路在卵泡發(fā)育中起關(guān)鍵作用，c-Myc 是 Notch 信號的直接靶基因，Notch信號通過誘導(dǎo)c-Myc 的表達(dá)來調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖。Zhang 等[30]利用 Notch 通路抑制劑 L-685、458 和DAPT 處理體外培養(yǎng)的原始卵泡后，卵泡發(fā)育完全停滯，原因是c-Myc 的表達(dá)水平降低，抑制了顆粒細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致卵母細(xì)胞變性、胞漿濃縮，最終引起卵泡發(fā)育不全。顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的相互作用對于卵泡的正常發(fā)育、排卵非常重要。

2.2 顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞間重要的通訊結(jié)構(gòu)對排卵的影響

Gershon 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間形成重要通訊結(jié)構(gòu)——縫隙鏈接參與了卵泡生長、卵子發(fā)育和黃體形成的過程。其中，連接蛋白37（connexin-37，Cx-37）和連接蛋白 43（Connexin-43，Cx-43）已被證實在調(diào)節(jié)卵泡生長和卵母細(xì)胞成熟中起著關(guān)鍵作用[32]。Cx-37 是連接卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的連接蛋白，被敲除Cx-37 的小鼠，其卵母細(xì)胞和卵丘之間細(xì)胞偶聯(lián)被破壞，細(xì)胞核成熟受阻，無法正常排卵[33]。Cx-43 是連接卵丘細(xì)胞和壁層顆粒細(xì)胞之間的連接蛋白，在大鼠卵巢中卵泡的發(fā)育和成熟過程中均受到Cx-43 的周期性調(diào)節(jié)，排卵前 Cx-43 在卵丘細(xì)胞和壁層顆粒細(xì)胞中大量合成，排卵后Cx-43 的表達(dá)被迅速抑制[34]。值得注意的是，存在于卵巢中的TGF- 超家族的亞型成員 TGF- 1 與 Cx-43 之間，在周期性表達(dá)的時空上有著一致性。TGF- 1 通過在顆粒細(xì)胞中調(diào)節(jié)Cx-43 的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞間通訊，從而促進(jìn)排卵[35]。

2.3 LH 峰對顆粒細(xì)胞相關(guān)信號通路的作用

LH 峰通過激活顆粒細(xì)胞下游信號通路，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞生長后期細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核成熟、排卵以及排卵后黃體的形成[36]。LH 與成熟卵泡壁層顆粒細(xì)胞上的經(jīng)典G 蛋白偶聯(lián)受體LHR 結(jié)合，介導(dǎo)激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases 1/2，Erk 1/2）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）和蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）[37]等信號通路。這些不同的信號級聯(lián)是卵母細(xì)胞成熟和排卵過程中重要的信號通路。

LH 峰激活ERK 1/2 被認(rèn)為是調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)、卵丘擴展和排卵的關(guān)鍵通路[38]。Fan 等[39]發(fā)現(xiàn)，被敲除Erk 1/2 的小鼠，其卵丘擴展受阻，卵泡雖然可破裂排卵，但不能形成黃體，進(jìn)而導(dǎo)致雌鼠不育。HSIEH等[40]對排卵前后顆粒細(xì)胞中提取的RNA 進(jìn)行微陣列分析，觀察結(jié)果顯示，LH 誘導(dǎo)小鼠顆粒細(xì)胞類EGF 生長因子雙調(diào)蛋白（amphiregulin，AR）、上皮調(diào)節(jié)蛋白（epiregulin，EPI）和 細(xì)胞素（beta-cellulin，BTC），它們作用于壁層顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞胞外區(qū)EGF 受體（EGF receptor，EGFR），使其細(xì)胞內(nèi)特定酪氨酸殘基磷酸化，從而激活ErK 1/2 通路和PKC 的信號通路。研究表明，給小鼠注射 LH 類似物 hCG，可誘導(dǎo) AR、EPI 和BTC 表達(dá)量升高[41]，從而誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞分泌類EGF 生長因子，使卵丘細(xì)胞的 EGFR 活化，促使卵丘擴張和卵母細(xì)胞的成熟[42]。EGF 信號通路激活啟動卵丘擴展，EGF 引起卵丘細(xì)胞孕酮水平的上升，這可能在受精過程中起到精子趨化因子的作用，這一系列翻譯后修飾對卵母細(xì)胞核成熟起關(guān)鍵作用[43]。

長期以來，孕酮一直被認(rèn)為是調(diào)節(jié)女性生育能力、維持妊娠的重要激素，孕酮對排卵也具有重要作用[44]。LH 峰激增可迅速誘導(dǎo)孕酮特異性受體（progesterone receptor，PR）的 mRNA 表達(dá)，這種選擇性誘導(dǎo)發(fā)生在排卵前卵泡的壁層顆粒細(xì)胞中[45]。LH 峰通過 PKA/cAMP 介導(dǎo)的Erk 1/2 信號誘導(dǎo)PR，向超排大鼠注射含有hCG 的抗孕酮血清可抑制排卵[41]。在LH 峰刺激下，壁層顆粒細(xì)胞中會誘導(dǎo)ADAMTS-1 和Cathepsin L 兩種蛋白酶的表達(dá)，并啟動對卵泡破裂相關(guān)下游靶點的轉(zhuǎn)錄。ADAMTS-1 蛋白酶結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了細(xì)胞降解和卵泡壁溶解[46]，Cathepsin L 蛋白酶作用于細(xì)胞外基質(zhì)，用以維持卵泡壁的完整性[47]。PR 的倆個異構(gòu)體PRA 和 PRB 是同一個轉(zhuǎn)錄本翻譯而來，在 LH 誘導(dǎo)下，PRA 是主要的翻譯產(chǎn)物，對PR基因敲除的雌性小鼠即使在外源激素下也不能排卵，并且完全不育[44]。因此，LH 誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中的孕酮依賴性通路，從而介導(dǎo)了排卵過程。

3 卵丘擴展對卵母細(xì)胞成熟和排卵的影響

在LH 峰作用下，卵丘通過產(chǎn)生蛋白聚糖和糖蛋白，并在卵丘層周圍形成細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），稱為卵丘擴展。擴展的卵丘與卵母細(xì)胞形成緊密的復(fù)合體，可保護(hù)卵母細(xì)胞免受機械壓力，避免卵泡或輸卵管中的蛋白水解酶的降解，通過促進(jìn)輸卵管壺腹部捕獲卵母細(xì)胞并引導(dǎo)卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)運至受精部位[48]。卵丘擴展是通過顆粒細(xì)胞分泌類 EGF 生長因子[41]和 COCS 旁分泌前列腺素（prostaglandin，PG）的信號激活的[49]。

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是卵丘擴展的主要結(jié)構(gòu)骨架，透明質(zhì)酸合酶 2（hyaluronan synthase 2，Has 2）通過誘導(dǎo)透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白Tnfaip 6、I I 和Ptx 3 等下游基因，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成。Tnfaip 6 或I I 的缺失也會導(dǎo)致卵丘產(chǎn)生HA 不穩(wěn)定，使得卵丘在體內(nèi)或體外試驗均無法正常擴展[50]。I I 與HA 結(jié)合后導(dǎo)致排卵效率大幅度下降，排卵率和受精率下降近近50%[51]。Tnfaip 6 敲除小鼠和Ptx 3 敲除小鼠也表現(xiàn)出明顯的排卵障礙[52]。LH 峰后，前列腺素內(nèi)過氧化物合酶 2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，Ptgs 2）在顆粒細(xì)胞中迅速誘導(dǎo)，促進(jìn)排卵[53]。Ptgs 2 基因的敲除導(dǎo)致卵丘擴展受阻，排卵異常小鼠不育[54]。顆粒細(xì)胞主要產(chǎn)生前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE 2），它是卵巢中的花生四烯酸酯代謝產(chǎn)物，PGE 2 通過作用于其特異性受體 EP 2 發(fā)揮作用。小鼠卵丘細(xì)胞表達(dá)的EP 2功能缺失時，將會導(dǎo)致排卵和受精功能受損[55-56]。PG 的相關(guān)基因（如 Ptgs 2 和 Ptgs 4）、cAMP 信號相關(guān)基因（如Crem、Nmu 和Rgs 10）以及EGF 家族相關(guān)基因（如Areg、Ereg 和Btc）的基因表達(dá)，都起著啟動并放大LH 峰的作用。

卵丘擴展在促進(jìn)排卵的同時也會協(xié)助卵母細(xì)胞成熟。卵丘產(chǎn)生的蛋白聚糖通過與EGF 受體信號相結(jié)合，誘導(dǎo)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的活化[57]。一系列研究表明，卵丘的擴展依賴于Has 2、Ptx 3、Ptgs 2 和Tnfaip 6[58-60]轉(zhuǎn)錄水平的增加，與卵母細(xì)胞質(zhì)量呈正相關(guān)。在卵丘細(xì)胞中表達(dá)的透明質(zhì)酸受體CD 44 的mRNA 表達(dá)量與卵丘擴展程度也呈現(xiàn)正相關(guān)[61]。透明質(zhì)酸及其受體CD 44 的調(diào)控系統(tǒng)通過激活一些信號分子，誘導(dǎo)Cx-43 的酪氨酸磷酸化，卵母細(xì)胞的生發(fā)泡破裂，觸發(fā)排卵[62]。透明質(zhì)酸及其受體CD 44 的調(diào)控系統(tǒng)通過影響卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的信號交流，調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)和后續(xù)排卵的過程[63]。

4 結(jié)語與展望

顆粒細(xì)胞誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)并為其提供能量物質(zhì)，卵母細(xì)胞又通過信號分子促進(jìn)顆粒細(xì)胞表達(dá)，它們之間的雙向調(diào)節(jié)促進(jìn)卵泡成熟和排卵。近年來，隨著輔助生殖技術(shù)和克隆技術(shù)的研究不斷深入，越來越多的學(xué)者認(rèn)識到顆粒細(xì)胞是影響雌性動物生殖能力的一個關(guān)鍵因素。通過探索顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的雙向調(diào)節(jié)，將卵母細(xì)胞成熟和排卵的相關(guān)通路聯(lián)系起來，可為人們進(jìn)一步揭示生殖細(xì)胞發(fā)育機制建立卵母細(xì)胞體外成熟體系以及臨床不孕不育癥的預(yù)防和治療開辟新思路。