宋姍姍，宋興超，張如，叢波，劉琳玲

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省特種經(jīng)濟(jì)生物學(xué)省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130112）

水貂皮被稱為“裘皮之王”，每年的貿(mào)易量約占國際裘皮貿(mào)易量的70%[1]，在水貂育種中，與活體毛皮等級(jí)及干皮品質(zhì)相關(guān)的性狀均處于強(qiáng)選擇狀態(tài)，公、母水貂體重遺傳力分別為 0.48 和 0.43，公、母水貂皮張長(zhǎng)度的遺傳力均為 0.45[2]。因此，對(duì)水貂生長(zhǎng)性狀（如體重和體長(zhǎng)）相關(guān)基因進(jìn)行深入研究顯得尤為重要，并且培育體型大且毛皮品質(zhì)優(yōu)良的新品種已成為當(dāng)前水貂育種的目標(biāo)之一。20 世紀(jì)80 年代，遺傳標(biāo)記即分子遺傳標(biāo)記技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)可準(zhǔn)確、有效地揭示物種的遺傳變異特性[3-4]，遺傳標(biāo)記經(jīng)歷了四個(gè)階段，即形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和DNA 分子標(biāo)記。伴隨DNA 重組技術(shù)的出現(xiàn)，科學(xué)家開始研究DNA 多態(tài)性的遺傳標(biāo)記方法，這使分子遺傳標(biāo)記技術(shù)輔助常規(guī)動(dòng)物育種成為可能。分子遺傳標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)在很大程度上提高了育種的有效性，因而分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在水貂育種領(lǐng)域備受關(guān)注。目前，應(yīng)用較廣泛的分子遺傳標(biāo)記主要有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析技術(shù)（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、DNA指紋分析技術(shù)（DNA fingerprint）、隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性 DNA 技術(shù)（random amplified polymorphism DNA，RAPD）、短段串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（amplified fragment length polymorphism，AFLP）。本文將概述分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在水貂生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀，旨在為今后該技術(shù)在水貂育種中的應(yīng)用提供參考。

1 水貂生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因分子遺傳標(biāo)記

2007 年，Anistoroaei 等[4]首次獲得水貂簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記的遺傳圖譜，并且經(jīng)過2 次補(bǔ)充完善[5-6]。Thirstrup等[7]利用該遺傳圖譜發(fā)現(xiàn)影響毛皮質(zhì)量和皮張長(zhǎng)度的數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTL）；此外，Cirera 等[8]發(fā)現(xiàn) TYRP1 基因內(nèi)含子 2 中一個(gè)長(zhǎng)插入片段與美洲水貂帕洛米諾毛色表型存在關(guān)聯(lián)；同時(shí)采用細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）文庫測(cè)序，在水貂基因組中進(jìn)行同源搜索查找生長(zhǎng)相關(guān)基因[9]。Thirstrup 等[10]采用限制性酶切位點(diǎn)關(guān)聯(lián)DNA 測(cè)序技術(shù)（restriction-site-associated DNA sequencing，RAD-seq），在水貂中檢測(cè)到380個(gè)SNPs。大量研究表明高通量測(cè)序技術(shù)已在水貂育種中廣泛應(yīng)用，用高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建不同類型的基因組DNA 文庫，并進(jìn)行序列測(cè)定。然后使用生物信息學(xué)方法對(duì)測(cè)序得到的序列進(jìn)行拼接、組裝和注釋，從而獲得該物種完整的基因組序列信息。Cai 等[11]首次報(bào)道水貂全基因組序列信息，這使得鑒定整個(gè)水貂基因組中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）成為可能。Cai 等[12]采用高通量測(cè)序技術(shù)獲得2 496 只北美水貂的SNP，經(jīng)過多輪篩選，保留28 336 個(gè)高質(zhì)量SNP 和2 352 個(gè)個(gè)體用于全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）。針對(duì)水貂體重、行為以及與貂皮質(zhì)量有關(guān)的 10 個(gè)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS），發(fā)現(xiàn)WWC3、MAP2K4、SLC7A1 和 USP22 基因可作為水貂體重和毛皮長(zhǎng)度的候選基因。2019 年榮敏等[13]利用Illumina HiSeqTM2500 高通量測(cè)序平臺(tái)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫對(duì)美國短毛黑水貂快速生長(zhǎng)過程中差異顯著性基因進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)與肌肉生長(zhǎng)相關(guān)顯著富集GO 條目有66 條，其中44 個(gè)相關(guān)基因差異表達(dá)，這些差異基因可能調(diào)控水貂的快速生長(zhǎng)，可以為下一步深入研究提供數(shù)據(jù)。

動(dòng)物的生長(zhǎng)軸為GH-GHR-IGF-1-IGF-1R，這些基因均可調(diào)控動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育。生長(zhǎng)激素（GH）是一種單鏈蛋白質(zhì)，幾乎能作用于機(jī)體所有類型的組織和細(xì)胞，通過影響骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化和調(diào)節(jié)機(jī)體的脂肪代謝來調(diào)控機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育[1]，下面將分別闡述水貂生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因的分子遺傳標(biāo)記。

1.1 生長(zhǎng)激素

生長(zhǎng)激素（GH）是一種肽類激素，由垂體中的生長(zhǎng)激素細(xì)胞合成和分泌，通過雙重作用機(jī)制促進(jìn)成骨、破骨細(xì)胞的增殖，從而調(diào)控機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育[14]。2010 年，李玉梅等[15]采用PCR-SSCP（PCR-single strand conformation polymorphism）方法研究水貂GH 基因多態(tài)性，結(jié)果顯示BB 基因型個(gè)體與AA 基因型個(gè)體皮張長(zhǎng)度有顯著相關(guān)。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)合并基因型與水貂皮長(zhǎng)性狀差異顯著。同年，李玉梅等[16]采用同種方法研究發(fā)現(xiàn)C→A 突變產(chǎn)生的3 種基因型與水貂體重具有相關(guān)性，BB 基因型個(gè)體體重高于AA 基因型個(gè)體，2 次研究均采用PCR-SSCP 方法共同證實(shí)GH 基因可作為水貂生長(zhǎng)性狀相關(guān)的候選基因，PCR-SSCP 作為一種分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，是一種快速檢測(cè)基因的單個(gè)核苷酸變異的方法。上述檢測(cè)水貂GH 基因的2 個(gè)突變位點(diǎn)可作為水貂皮長(zhǎng)和體重性狀的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，為進(jìn)一步利用分子標(biāo)記輔助選擇開展水貂新品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1.2 胰島素樣生長(zhǎng)因子 1

胰島素樣生長(zhǎng)因子 1（IGF-1）是細(xì)胞生長(zhǎng)的重要調(diào)控因子[17]，肝臟可分泌體內(nèi)循環(huán)的IGF-1，前人研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育與其血液中IGF-1 濃度有關(guān)[18]。目前，IGF-1 基因作為影響動(dòng)物生長(zhǎng)的主控基因而成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1 在胚胎期可以促進(jìn)胎兒軟骨膜和軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育[19]，該基因再與GH 協(xié)同作用，重組的IGF-1 能刺激紅細(xì)胞的生成。榮敏等[20]對(duì)6 個(gè)水貂群體進(jìn)行IGF-1 基因與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析，首次并未發(fā)現(xiàn)該基因與水貂生長(zhǎng)性狀具有相關(guān)性，但經(jīng)過再次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2 個(gè)SNPs，其中1 個(gè)外顯子內(nèi)存在一處C→G 突變的雜合型AB 型個(gè)體體重和皮張長(zhǎng)度高于純合 AA 型，具有極顯著差異[21]。隨著研究的深入，霍自雙[22]發(fā)現(xiàn)IGF-1 基因的g.6 194G>A 突變位點(diǎn)對(duì)紅眼白水貂的體長(zhǎng)有極顯著影響（P ＜ 0.01），g.71 699C ＞ A 突變位點(diǎn)與體長(zhǎng)顯著相關(guān)（P ＜ 0.05）。單核苷酸多態(tài)性（SNP）分子遺傳標(biāo)記是繼限制性片段多態(tài)性（RFLP）與微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）后產(chǎn)生的新一代分子標(biāo)記，其特點(diǎn)是分布不均勻、豐度高和自動(dòng)化檢測(cè)。當(dāng)前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，上述研究獲得水貂 IGF-1 基因的3 個(gè)SNPs 可作為紅眼白水貂體長(zhǎng)性狀的遺傳標(biāo)記，今后應(yīng)逐步構(gòu)建并完善水貂SNP 遺傳圖譜，分析篩查到的候選基因突變位點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性，以期進(jìn)一步豐富水貂分子遺傳學(xué)相關(guān)研究。

1.3 胰島素樣生長(zhǎng)因子 1 受體

胰島素樣生長(zhǎng)因子 1 受體（IGF-1R）基因作為生長(zhǎng)軸的終端與 IGF-1 結(jié)合形成復(fù)合體發(fā)揮生物學(xué)作用，可使IGF-1R 的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，從而激活磷酸肌醇 3-激酶（PI3K）和 Ras 蛋白信號(hào)通路來阻斷細(xì)胞凋亡[23]，調(diào)控GH 的分泌、影響機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡、增殖和分化[24-25]。宋姍姍[26]以大體型的銀藍(lán)水貂和小體型的美國短毛黑水貂為研究對(duì)象，研究IGF-1R 基因與生長(zhǎng)性狀相關(guān)性，結(jié)果顯示c.1 782G ＞ A 與美國短毛黑水貂體重顯著相關(guān)（P ＜0.05），且雜合型AA 型個(gè)體體重大于其他2 個(gè)基因型個(gè)體。2019 年進(jìn)一步研究，以紅眼白水貂、金州黑水貂和咖啡水貂為研究對(duì)象，篩查IGF-1R 基因CDS 序列的突變位點(diǎn)，推斷得出 c.207G ＞ A 與金州黑水貂和咖啡水貂體長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)（P ＜ 0.05），其中金州黑水貂野生型GG 基因型為優(yōu)勢(shì)基因型；c.1 782G ＞A與咖啡水貂的體長(zhǎng)顯著相關(guān)（P ＜ 0.05），c.1 782G ＞A 與咖啡水貂的體重差異極顯著，其中突變雜合GA基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。合并基因型分析發(fā)現(xiàn)：金州黑水貂不同合并基因型與水貂體長(zhǎng)、體重均差異顯著，GAGG 基因型個(gè)體的體長(zhǎng)和體重均顯著高于其他基因型個(gè)體[27]。初步推斷GGGA 基因型可能是影響金州黑水貂體長(zhǎng)與體重的有利基因型，綜上2 次試驗(yàn)認(rèn)為IGF-1R 基因可能是影響水貂生長(zhǎng)性狀的候選基因。通過研究 5 個(gè)種群水貂 IGF-1R 基因并篩查到 SNP 位點(diǎn)，該位點(diǎn)可作為水貂生長(zhǎng)性狀選育的分子遺傳標(biāo)記，為培育大體型的優(yōu)良水貂品種奠定了理論基礎(chǔ)。

1.4 阿片黑素促皮質(zhì)激素原

阿片黑素促皮質(zhì)激素原（pro-opiomelanocortin，POMC）是垂體多種激素的前體，相關(guān)肽有黑素皮質(zhì)素、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocor ticotropic hormore，ACTH）和促脂素（lipotrophic hormone，LPH）三大類，可調(diào)節(jié)食物的攝入，并且影響機(jī)體的能量平衡[28]。研究發(fā)現(xiàn) POMC 基因序列位點(diǎn)的突變可以影響機(jī)體的進(jìn)食量，從而決定機(jī)體的體重[29]。劉琳玲等[30]篩查到POMC 基因存在 4 個(gè)變異位點(diǎn)，g.171A ＞ G 位點(diǎn)與咖啡貂的體重有顯著相關(guān)，AA 型為優(yōu)勢(shì)基因型，個(gè)體體重最高；g.470T ＞G 位點(diǎn)與咖啡貂的體長(zhǎng)具有相關(guān)性，TT 基因型為優(yōu)勢(shì)基因型；g.470T ＞G 位點(diǎn)與紅眼白水貂的體重顯著相關(guān)，TT 型為優(yōu)勢(shì)基因型；g.514C ＞T 位點(diǎn)與紅眼白水貂的體長(zhǎng)差異顯著（P ＜0.05），CT型個(gè)體體長(zhǎng)大于CC型和TT型個(gè)體。研究發(fā)現(xiàn)POMC基因的變異可影響水貂的體長(zhǎng)與體重性狀，還發(fā)現(xiàn)POMC基因具有豐富的遺傳多樣性，得出水貂的POMC 基因g.171A ＞ G 和 g.470T ＞G 這 2 個(gè)突變位點(diǎn)可作為咖啡水貂和紅眼白水貂體長(zhǎng)和體重性狀的分子遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。

1.5 垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子

垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子（PIT-1）是POU 結(jié)構(gòu)域中的一種蛋白，也是一種DNA 結(jié)合蛋白，可調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞分化，調(diào)控垂體激素分泌細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育[31]。楊洪雁[32]采用 PCR-RFLP 方法，檢測(cè)了水貂PIT-1 基因多態(tài)性并與水貂生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，C43T 突變位點(diǎn)與水貂體重、胸圍和腹圍性狀差異極顯著（P ＜0.01），A143G 變異位點(diǎn)與水貂體長(zhǎng)、體重、體高、胸圍和腹圍性狀差異極顯著（P ＜0.01），DD 基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)合并基因型 AADD 基因型個(gè)體的體重、胸圍、屠宰體重顯著大于BBCC 基因型個(gè)體，BBDD 基因型個(gè)體體長(zhǎng)顯著大于其他基因型個(gè)體（P ＜ 0.05）。因此水貂PIT-1 基因的C43T 和A143G 突變位點(diǎn)的合并基因型分析發(fā)現(xiàn)AADD 基因型個(gè)體和BBDD 基因型個(gè)體為優(yōu)勢(shì)基因型，可作為水貂體重、胸圍、屠宰體重和體長(zhǎng)性狀的遺傳標(biāo)記。上述研究采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析技術(shù)（RFLP），該技術(shù)是第一代 DNA 標(biāo)記。RFLP作為遺傳標(biāo)記具有其獨(dú)特性：①共顯性的標(biāo)識(shí)；②結(jié)果不受環(huán)境因素影響；③非等位基因之間無基因互作效應(yīng)。RFLP 分析技術(shù)在水貂育種中的應(yīng)用將會(huì)加快該物種優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的選育進(jìn)展。

2 小結(jié)與展望

分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在水貂生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因研究中發(fā)揮了重要的作用，大力推動(dòng)了水貂育種的進(jìn)程。相關(guān)基因包括生長(zhǎng)軸相關(guān)基因GH-GHR-IGF-1-IGF-1R，在這些基因中應(yīng)用的遺傳標(biāo)記技術(shù)主要有 AFLP、RFLP 和SNP 技術(shù)，其中單核苷酸多態(tài)性（SNP）具有明顯優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈冐S富，遺傳穩(wěn)定且適合高通量自動(dòng)化分析。然而，由于缺乏水貂有關(guān)參考基因組側(cè)翼標(biāo)記序列的信息，這些標(biāo)記的可用性仍然受到阻礙且成本較高。伴隨組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與創(chuàng)新，新一代分子遺傳標(biāo)記技術(shù)即簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（genotyping-by-sequencing，GBS）應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)主要利用二代測(cè)序（NGS）的優(yōu)勢(shì)來實(shí)現(xiàn)低成本和高通量基因分型，通過使用限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease，RE）降低基因組的復(fù)雜性，然后生成NGS 序列標(biāo)簽[33]。通過選擇對(duì)甲基化敏感的RE，可以避免基因組的重復(fù)區(qū)域，從而降低基因組的復(fù)雜性[34]。下一步應(yīng)廣泛應(yīng)用GBS技術(shù)在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)遺傳標(biāo)記，從而進(jìn)行種群遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究，全面開發(fā)和研制功能性分子標(biāo)記和特異基因芯片，使基礎(chǔ)研究成果應(yīng)用于實(shí)際育種生產(chǎn)中成為可能，為真正進(jìn)入分子設(shè)計(jì)育種時(shí)代奠定基礎(chǔ)。分子標(biāo)記雖然為水貂育種開辟了一扇大門，但能否在育種實(shí)踐中發(fā)揮應(yīng)有的作用，還需要滿足以下4 個(gè)方面：①是否能找到與目的基因性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記；②是否能繪制遺傳標(biāo)記多態(tài)性豐富的遺傳圖譜；③能否實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析分子標(biāo)記，簡(jiǎn)化試驗(yàn)，大大降低成本；④是否能改進(jìn)預(yù)測(cè)育種值的方法。當(dāng)前，這4 個(gè)方面已經(jīng)有所改進(jìn)和完善，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記將在水貂育種中占有重要地位。