平大冰 崔紅艷 孫鑫 黃愷 彭淵 陶艷艷 劉成海

肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要細胞學(xué)基礎(chǔ)，其活化與許多途徑和介質(zhì)密切相關(guān)，包括自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激反應(yīng)等[1]。有研究證實，過量的活性氧(reactive oxygen，ROS)激活HSC誘發(fā)纖維化形成，氧化應(yīng)激同時可以激活ERK通路，參與MAPK信號通路的傳導(dǎo)，促進HSC的增殖和活化[2-4]。本研究采用二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型，觀察肝纖維化發(fā)展與消退過程中過氧化損傷、ERK及HSC活化關(guān)系，探討氧化損傷通過ERK信號通路誘導(dǎo)肝纖維化的可能病理機制。

資料與方法

一、實驗動物

Wistar清潔級雄性大鼠74只，體質(zhì)量為(150±10)g，由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供。模型制備參照文獻[5]，以10 μL/kg劑量予大鼠腹腔注射DMN，每天1次，每周3 d，持續(xù)造模4周，分別在染毒后1 d、3 d、1周、2周、3周、4周末，與染毒停止后1周、2周、4周，共9個時間觀察點處死模型大鼠。另設(shè)正常對照組大鼠10只，按相同劑量腹腔注射0.9% NaCl溶液。

二、試劑與抗體

DMN，羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)標(biāo)準品購自日本東京化成工業(yè)株式會社；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)試劑盒均購自中國南京建成生物有限公司；明膠購自美國Amresco公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增試劑盒為日本Takara公司產(chǎn)品。小鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體購自美國Sigma公司；小鼠抗大鼠單克隆磷酸化ERK抗體、多克隆兔抗大鼠ERK1抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；小鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2單克隆抗體購自美國Antibody Diagnostica公司；小鼠抗人MMP-9單克隆抗體、小鼠抗人組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-1單克隆抗體、小鼠抗人TIMP-2單克隆抗體均為美國NeoMarker公司產(chǎn)品。辣根過氧化物酶標(biāo)記驢抗兔抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記驢抗鼠抗體購自美國Amersham Pharmacia Biotech公司。

三、實驗方法

(一)肝組織總RNA提取與mRNA表達 Trizol抽提肝組織RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR儀進行cDNA擴增，以β-actin作為內(nèi)參照基因。每個樣本設(shè)置3個副管。引物由上海生工公司合成、純化與鑒定，引物序列見表1。

(二)免疫組化染色觀察α-SMA表達變化 大鼠肝組織切片脫蠟，0.3%H2O2孵育滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，檸檬酸鹽緩沖液煮沸法抗原熱修復(fù)，5%BSA封閉，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育，DAB顯色，Image Pro Plus軟件進行半定量分析。

(三)明膠酶圖法觀察肝組織MMP-2、MMP-9活性 參考文獻[6]的檢測方法，肝組織100 mg勻漿裂解蛋白后定量，8%SDS-PAGE(含0.1%明膠)還原但非變性電泳，洗脫漂洗后，將凝膠置于孵育液中37 ℃孵育18～20 h，經(jīng)考馬斯亮藍染色，可顯示出MMP-2和MMP-9及活化的MMP-2位于藍色背景下的透亮帶。

表1 Collagen I mRNA擴增引物序列

(四)蛋白免疫印跡法檢測肝組織α-SMA、MMP2/9、TIMP1/2、ERK/p-ERK蛋白表達 肝組織100 mg裂解蛋白后定量，10%SDS-PAGE凝膠上電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜中，5%BSA封閉，4℃一抗(濃度均為1：200)孵育過夜，PBS緩沖液洗膜后將膜與相應(yīng)熒光標(biāo)記二抗室溫孵育1 h后用Li-Cor奧德賽成像儀進行掃描拍照，每個實驗重復(fù)3批不同樣本。

(五)肝組織脂質(zhì)過氧化測定 SOD、GST活性；GSH含量，按照試劑盒說明書步驟測定。

四、統(tǒng)計方法

結(jié) 果

一、模型大鼠肝組織膠原沉積變化

天狼猩紅染色結(jié)果顯示，染毒2周膠原纖維沉積，出現(xiàn)菲薄的纖維間隔，4周末時膠原纖維沉積明顯，纖維間隔與假小葉形成，肝組織出現(xiàn)纖維化。停止染毒后肝臟膠原沉積減輕，肝纖維化有所消退，但直至8周末時仍可見輕微纖維間隔。染毒開始后，模型大鼠肝組織Hyp含量持續(xù)升高，染毒4周時含量為正常組的1.5倍，停止染毒后，Hyp含量開始下降，8周時仍高于正常水平(見圖1，表2)。

二、模型大鼠肝組織α-SMA蛋白表達變化

免疫組化染色觀察到正常大鼠肝組織α-SMA蛋白少量表達，散見于匯管區(qū)血管壁，肝小葉內(nèi)未見陽性灶。隨DMN染毒開始，α-SMA表達增加，主要見于肝竇壁和纖維間隔處。停止染毒后，α-SMA表達下降，但仍高于正常肝組織(見圖2，表2)。

三、模型大鼠肝組織MMP-2和MMP-9活性變化

正常組大鼠MMP-2活性較弱。肝纖維化形成過程中MMP-2活性逐漸升高；停止染毒后，MMP-2活性逐漸減弱，8周時基本恢復(fù)至正常水平。正常組MMP-9活性極低，在DMN造模過程中MMP-9變化趨勢與MMP-2相似(見圖3，表2)。

注：A 正常組；B 模型組1周；C 模型組2周；D 模型組4周；E模型組6周；F模型組8周

注：A 正常組；B 模型組1周；C 模型組2周；D 模型組4周；E模型組6周；F模型組8周

圖3 大鼠肝組織MMP-2和MMP-9活性動態(tài)變化

四、模型大鼠肝組織Collagen I mRNA的表達變化

實時PCR結(jié)果顯示，正常組大鼠肝組織僅少量表達collagen I，染毒3 d時表達明顯升高，其后持續(xù)高表達，4周升高最明顯，DMN染毒停止后，collagen I mRNA水平有所下降，但仍維持在較高水平(見表2)。

五、肝組織α-SMA、MMP-2/9、TIMP-1/2、ERK/p-ERK蛋白表達變化

正常組大鼠肝組織α-SMA、MMP-2/9、TIMP-1/2蛋白均少量表達。在肝纖維化形成過程中，各蛋白表達量逐漸增加，并隨DMN染毒時間持續(xù)高表達。停止染毒后，各蛋白表達均逐漸減少，8周時MMP-2蛋白表達已接近正常水平，α-SMA、MMP-9、TIMP-1/2蛋白仍較正常組大鼠表達增多。ERK蛋白水平于正常組及模型組大鼠肝組織中無明顯變化，然而ERK磷酸化(p-ERK)水平在染毒1 d時即有輕度增加，2周時表達升高至正常組的2倍。其后在整個造模過程中p-ERK持續(xù)高表達，4周達到最高峰。停止染毒后，p-ERK水平逐漸下降，但8周時仍高于正常水平(見圖4，表3)。

圖4 大鼠肝組織α-SMA、MMP-2/9、TIMP-1/ 2、ERK/p-ERK蛋白表達變化

表2 大鼠肝組織膠原、α-SMA及MMP-2/9表達變化(±s)

表3 肝組織蛋白表達變化定量(±s)

六、模型大鼠肝組織脂質(zhì)過氧化損傷動態(tài)變化

肝纖維化形成過程中，大鼠肝組織SOD、GST活性逐漸降低(P<0.05)，停止染毒后，二者活性有所增高但仍低于正常水平。肝組織GSH含量在DMN染毒早期出現(xiàn)一過性增高，而后明顯降低(P<0.05)，在肝纖維化消退過程中，含量逐漸增加并接近正常水平(見表4)。

七、肝組織SOD活性與p-ERK蛋白表達及Hyp含量的相關(guān)性分析

直線相關(guān)分析表明，在肝纖維化形成和消退過程中，SOD活性與Hyp含量及SOD活性與p-ERK蛋白表達均呈明顯負相關(guān)(P<0.05)；p-ERK蛋白表達與Hyp含量呈明顯正相關(guān)(P<0.01)。見圖5。

討 論

DMN是一種常見的具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性的化學(xué)物質(zhì)，其主要靶器官為肝臟，高劑量使用可引起肝組織壞死和肝纖維化[7，8]。肝纖維化的形成與HSC的活化關(guān)系密切，活化HSC轉(zhuǎn)換為肌成纖維細胞，分泌大量的α-SMA和膠原沉積于肝臟，HSC還可以分泌MMP和TIMP，通過調(diào)節(jié)ECM的沉積和降解，影響肝纖維化的進展[9]。目前發(fā)現(xiàn)至少有4種TIMP存在，但僅有TIMP-1和TIMP-2在肝組織中表達[10]，TIMP-1和TIMP-2可以分別與IV型膠原酶MMP-9和MMP-2前體結(jié)合，破壞正常肝臟基質(zhì)，抑制間質(zhì)膠原酶降解膠原纖維，促使HSC進一步增殖活化。本研究發(fā)現(xiàn)，DMN染毒開始，大鼠肝組織細胞出現(xiàn)損傷壞死，膠原纖維大量沉積，在肝纖維化形成過程中肝組織內(nèi)α-SMA以及MMP-2/9和TIMP-1/2的表達量明顯增加，MMP-2/9活性明顯增高，停止染毒，肝纖維化逐漸消退，相關(guān)蛋白表達減少。

有研究發(fā)現(xiàn)，在DMN造模初期，會引起過多游離脂肪酸沉積于肝細胞，產(chǎn)生氧自由基激發(fā)脂質(zhì)過氧化，激活HSC，加快肝纖維化的進程[11]。ROS是氧化還原過程中產(chǎn)生的化學(xué)活性分子，是細胞代謝，尤其是線粒體代謝的副產(chǎn)物，當(dāng)細胞ROS量超過機體抗氧化能力時可引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)導(dǎo)致細胞受損。生理狀態(tài)下，細胞會產(chǎn)生如SOD等抗氧化酶系維持正常的氧化平衡狀態(tài)，以保護細胞和組織免受過量ROS攻擊[12]。GST是GSH結(jié)合反應(yīng)的關(guān)鍵酶，催化谷胱甘肽結(jié)合多種化合物和環(huán)氧化物，與肝細胞內(nèi)存在的SOD和過氧化氫酶等酶類抗氧化劑和還原型GSH等非酶類抗氧化物質(zhì)共同抵御ROS所致的細胞損傷。因此，酶類抗氧化劑與非酶類抗氧化物質(zhì)常用作評估氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化形成過程中，肝組織SOD活性、GST活性明顯降低，GSH含量在早期出現(xiàn)一過性增高，染毒1周時開始明顯降低，而停止染毒后，二者活性有所增高但仍低于正常水平。提示DMN誘導(dǎo)肝纖維化形成過程中，模型組大鼠體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，機體抗氧化能力降低，在停止染毒以后，脂質(zhì)過氧化損傷明顯恢復(fù)，大鼠肝組織纖維化明顯減輕，且氧化應(yīng)激反應(yīng)可能與DMN大鼠肝纖維化的形成和消退有關(guān)。

表4 肝組織SOD活性、GST活性及GSH含量的動態(tài)變化(±s)

圖5 SOD活性與Hyp含量及p-ERK的相關(guān)性分析

既往研究發(fā)現(xiàn)，肝組織內(nèi)ROS的過量累積，會通過脂質(zhì)過氧化作用引起肝細胞、巨噬細胞等炎癥細胞產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，從而介導(dǎo)HSC分化、增殖和膠原的形成[14]。還有研究認為，除上述旁分泌機制外，ROS還可以直接刺激HSC的活化和增殖[15]。為了探討氧化應(yīng)激反應(yīng)如何刺激HSC增殖活化，本研究觀察了近年來倍受關(guān)注的ERK信號通路。ERK通路是各種細胞因子影響HSC增殖和活化的重要通路之一，其有ERK1和ERK2兩種異構(gòu)體，磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)可以轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，刺激HSC增殖和活化[16-18]。本研究結(jié)果顯示，肝纖維化形成過程中，ERK蛋白水平表達在正常組及模型組大鼠肝組織沒有明顯差異，而p-ERK1/2水平在肝纖維化形成過程中明顯增加，整個染毒過程中持續(xù)高表達。停止染毒后，p-ERK1/2水平隨肝纖維化消退有所下降，但仍高于正常水平。

綜上所述，在DMN染毒過程中，模型組大鼠肝組織肝細胞損傷，抗氧化物質(zhì)SOD、GST、GSH表達量明顯下降，機體氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯，HSC活化，肝纖維化形成，同時伴有MAPK/ERK信號通路p-ERK1/2的高表達；在停止染毒后，肝纖維化明顯消退，抗氧化物質(zhì)及p-ERK表達均不同程度恢復(fù)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，抗氧化物質(zhì)SOD活性與Hyp含量呈負相關(guān)，p-ERK蛋白表達與Hyp含量呈正相關(guān)，同時肝組織SOD活性與p-ERK蛋白表達也呈負相關(guān)。表明氧化應(yīng)激反應(yīng)與DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的形成和消退有關(guān)，且其可能是通過ERK信號通路傳導(dǎo)影響HSC活性和肝纖維化的進程。