李 巍，馮衛(wèi)能，葉國(guó)麟

(佛山市第一人民醫(yī)院，廣東 佛山 528000)

肺癌在癌癥相關(guān)死亡中排第一位，非小細(xì)胞肺癌約在所有肺癌中占85%[1]。近來，根據(jù)驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)行靶向治療的理念已經(jīng)形成，其中EGFR基因突變是靶向治療的一個(gè)最重要的驅(qū)動(dòng)基因[2]。EGFR-TKI已成為一線治療EGFR突變型晚期非小細(xì)胞肺癌患者的首選方法。但另一方面，雖然同為EGFR突變型晚期非小細(xì)胞肺癌患者，EGFR-TKI的療效仍然存在較大差異，有20%～30%患者無效，有的患者PFS超過1年，而有的患者初始治療有效但很快出現(xiàn)疾病進(jìn)展。近年來，越來越多的臨床前研究結(jié)果顯示乳腺癌易感基因1(BRCA1)表達(dá)與突變型非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI療效相關(guān)。最近公布的高質(zhì)量的臨床研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了BRCA1表達(dá)與EGFR-TKI治療突變型非小細(xì)胞肺癌的療效相關(guān)。在予EGFR-TKI一線治療的突變型晚期非小細(xì)胞肺癌患者中，BRCA1高表達(dá)者的中位PFS為10個(gè)月，而BRCA1低表達(dá)者的中位PFS長(zhǎng)達(dá)27個(gè)月，兩者具有非常大的差異。而且，兩者療效的差異與是否存在T790M突變及c-MET基因擴(kuò)增無關(guān)，BRCA1是影響療效的獨(dú)立因素[3]。這些研究結(jié)果提示抑制BRCA1的表達(dá)可望進(jìn)一步提高晚期非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI的療效。最近研究發(fā)現(xiàn)，HDAC抑制劑(伏立諾他)可減少轉(zhuǎn)錄因子E2F1與BRCA1啟動(dòng)子結(jié)合而下調(diào)BRCA1轉(zhuǎn)錄，從而間接抑制BRCA1表達(dá)[4]。因此，本文的研究目的是探討HDAC抑制劑是否可以通過降低乳腺癌易感基因BRCA1表達(dá)增強(qiáng)EGFR-TKI對(duì)突變型非小細(xì)胞肺癌的作用。

1 研究方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株H460(K-RAS突變)和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1975(EGFR合并T790M突變)，K-RAS突變可導(dǎo)致原發(fā)耐藥，對(duì)吉非替尼不敏感，而H1975雖然是EGFR突變型，但它同時(shí)含L858R(增加敏感性)和T790M(增加抗性)突變，T790M是吉非替尼獲得性耐藥的主要原因(占50%～60%)，所以對(duì)吉非替尼也不敏感。

1.2構(gòu)建高表達(dá)BRCA1基因的肺癌細(xì)胞株：胎盤中提取總RNA，設(shè)計(jì)引物，RT-PCR方法克隆BRCA1基因，以羧基端插入pcDNA3.1 ( + )真核表達(dá)載體中。通過DNA序列測(cè)定,菌液提取質(zhì)粒,酶切鑒定插入基因片段的正確性。提取質(zhì)粒pcDNA3.1-BRCA1，用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞，獲得穩(wěn)定高表達(dá)BRCA1細(xì)胞株(H461和H1976)。提取細(xì)胞總蛋白，Western blot方法鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞BRCA1表達(dá)情況。

1.3檢測(cè)伏立諾他增強(qiáng)突變型非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI敏感性的作用：①實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)： 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H461和H1976細(xì)胞接種培養(yǎng)板，按以下實(shí)驗(yàn)分組予不同處理。②實(shí)驗(yàn)分組：分為以下兩組：EGFR-TKI組：以吉非替尼10 μmol/L處理；伏立諾他聯(lián)合吉非替尼組：以吉非替尼10 μmol/L+伏立諾1.0 μM處理；③培養(yǎng)24～48 h后收集細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測(cè)藥物對(duì)H461和H1976細(xì)胞增殖的抑制，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.4檢測(cè)伏立諾他對(duì)EGFR突變型非小細(xì)胞肺癌BRCA1表達(dá)的影響：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H461和H1976細(xì)胞，予伏立諾1.0 μM處理，培養(yǎng)24～48 h后收集細(xì)胞，應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞BRCA1蛋白表達(dá)水平，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞BRCA1基因的mRNA水平?？瞻讓?duì)照組：加入相應(yīng)體積1640培養(yǎng)基。

2 結(jié)果

2.1伏立諾他增強(qiáng)突變型非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI敏感性：實(shí)驗(yàn)分為兩組后，EGFR-TKI組(對(duì)照組)以吉非替尼10 μmol/L處理；伏立諾他聯(lián)合吉非替尼組(實(shí)驗(yàn)組)以吉非替尼10 μmol/L+伏立諾他1.0 μM處理。應(yīng)用MTT法檢測(cè)藥物對(duì)H461和H1976細(xì)胞增殖的抑制，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。對(duì)于細(xì)胞株H460，ED50 (半數(shù)有效劑量)在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別是21.4 μM和33.0 μM；對(duì)于細(xì)胞株H1975，ED50在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別是27.8和31.7 μM。見表1。

表1 伏立諾他增強(qiáng)突變型非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI敏感性

2.2伏立諾他對(duì)BRCA1表達(dá)的影響：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H461和H1976細(xì)胞，予伏立諾他1.0 μM處理(實(shí)驗(yàn)組)，培養(yǎng)24～48 h后收集細(xì)胞，應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞BRCA1蛋白表達(dá)水平，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞BRCA1基因的mRNA水平?？瞻讓?duì)照組：加入相應(yīng)體積1640培養(yǎng)基。通過RT-PCR法發(fā)現(xiàn)，對(duì)于H1976細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組BRCA1基因的mRNA水平減少>85%；對(duì)于H461細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組BRCA1基因的mRNA水平減少>75% (見表2、圖1)。通過Western blot方法，可以清晰地發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組BRCA1基因表達(dá)顯著降低。

表2 伏立諾他對(duì)H461和H1976細(xì)胞BRCA1表達(dá)的影響

圖1 伏立諾他使H461和H1976細(xì)胞的BRCA1表達(dá)降低

3 討論

EGFR酪氨酸激酶域的突變已被證實(shí)與非小細(xì)胞肺癌對(duì)TKI治療的敏感性密切相關(guān)。Paez等研究表明，在對(duì)吉非替尼治療敏感的、具有EGFR突變的美國(guó)患者中，吉非替尼治療只對(duì)敏感的肺腺癌細(xì)胞株有生長(zhǎng)抑制作用，但不包括不敏感的腫瘤或細(xì)胞系[5-6]。對(duì)接受EGFR-TKI治療的非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行EGFR基因突變的檢測(cè)是預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的最重要的因素。根據(jù)基因狀況而形成的靶向治療已經(jīng)拉開帷幕并漸漸對(duì)傳統(tǒng)治療顯露優(yōu)勢(shì)[2]。對(duì)于存在EGFR19、21外顯子突變的晚期非小細(xì)胞肺癌患者，一線應(yīng)用EGFR-TKI治療的有效率高達(dá)70%～80%，中位PFS顯著提高到9～14個(gè)月，而中位生存期也大幅度延長(zhǎng)至30個(gè)月左右[7-8]。因此，EGFR-TKI已成為一線治療EGFR突變型晚期非小細(xì)胞肺癌患者的首選方法。但另一方面，雖然同為EGFR突變型晚期非小細(xì)胞肺癌患者，EGFR-TKI的療效仍然存在較大差異，有20%～30%患者無效，有的患者PFS超過1年，而有的患者初始治療有效但很快出現(xiàn)疾病進(jìn)展。此種情況是在EGFR-TKI治療EGFR突變型晚期非小細(xì)胞肺癌取得巨大進(jìn)步的同時(shí)呈現(xiàn)的另一重要新問題。

既往有相關(guān)研究認(rèn)為，EGFR活化突變型非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI療效的差異是因?yàn)榇嬖贓GFR-TKI原發(fā)性耐藥及獲得性耐藥。原發(fā)性耐藥可能與c-MET基因擴(kuò)增、PTEN表達(dá)缺失、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)高表達(dá)等有關(guān)。而50%的獲得性耐藥及20%的獲得性耐藥分別與出現(xiàn)T790M突變、c-MET基因擴(kuò)增有關(guān)[9]。

目前認(rèn)為腫瘤的發(fā)生與機(jī)體內(nèi)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶的失衡密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞中發(fā)生組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)異常表達(dá)，組蛋白大部分呈低乙?；癄顟B(tài)。HDAC抑制劑(histone deacetylaseinhibitor，HDACi)能使腫瘤細(xì)胞中組蛋白乙?；教岣?，糾正腫瘤細(xì)胞中組蛋白異常的乙酰化狀態(tài)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，HDAC抑制劑可減少轉(zhuǎn)錄因子E2F1與BRCA1啟動(dòng)子結(jié)合而下調(diào)BRCA1轉(zhuǎn)錄，從而間接抑制BRCA1表達(dá)[4]。本研究中通過HDAC抑制劑伏立諾他，對(duì)于H1976細(xì)胞，加入伏立諾的實(shí)驗(yàn)組的BRCA1基因的mRNA水平減少大于85%；同樣，對(duì)于H461細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組的BRCA1基因的mRNA水平減少 >75%。通過Western blot方法，我們可以清晰地發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的BRCA1基因表達(dá)顯著降低。從而使伏立諾他聯(lián)合吉非替尼的實(shí)驗(yàn)組的ED50低于只加入吉非替尼的對(duì)照組。其中，對(duì)于細(xì)胞株H460，ED50 (半數(shù)有效劑量)在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別是21.4 μM和33.0μM；對(duì)于細(xì)胞株H1975，ED50在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別是27.8 μM和31.7μM。因此，增強(qiáng)了突變型非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI敏感性。

近年來，越來越多的臨床前研究結(jié)果顯示乳腺癌易感基因1(BRCA1)表達(dá)與突變型非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI療效相關(guān)。BRCA1定位于人染色體17q12—21，編碼蛋白含有1 863個(gè)氨基酸殘基。BRCA1通過蛋白之間的相互作用來發(fā)揮其重要的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞周期調(diào)控，DNA損傷修復(fù)，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，細(xì)胞凋亡和泛素化等[11]。BRCA1作為DNA損傷修復(fù)過程的核心分子，在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在理化因素導(dǎo)致DNA損傷后，激活γ組蛋白2A變異體(γ histone family 2A variant，γH2AX)自磷酸化，磷酸化γH2AX促進(jìn)BRCA1招募各種修復(fù)蛋白形成多種BRCA1復(fù)合體聚集在DNA損傷位點(diǎn)進(jìn)行損傷修復(fù)[12]。而另一方面，目前許多研究證明EGFR除了通過RAS-RAF-MEK-ERK/MAPK、PI3K/AKT和Src/STAT三條主要信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的分化、凋亡外，還具有促進(jìn)DNA損傷修復(fù)的功能[13，14]。同樣，EGFR-TKI除了可以抑制上述通路的信號(hào)傳導(dǎo)，還可以通過抑制DNA損傷修復(fù)發(fā)揮作用[15]。因此，BRCA1高表達(dá)可能可以通過增強(qiáng)DNA修復(fù)功能降低突變型非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI的療效。最近公布的高質(zhì)量的臨床研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了BRCA1表達(dá)與EGFR-TKI治療突變型非小細(xì)胞肺癌的療效相關(guān)。在予EGFR-TKI一線治療的突變型晚期非小細(xì)胞肺癌患者中，BRCA1高表達(dá)者的中位PFS為10個(gè)月，而BRCA1低表達(dá)者的中位PFS長(zhǎng)達(dá)27個(gè)月，兩者具有非常大的差異。而且，兩者療效的差異與是否存在T790M突變及c-MET基因擴(kuò)增無關(guān)，BRCA1是影響療效的獨(dú)立因素[3]。這些研究結(jié)果提示抑制BRCA1的表達(dá)可望進(jìn)一步提高晚期非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI的療效。但目前尚未有直接抑制BRCA1表達(dá)的抑制劑。

總之，HDAC抑制劑伏立諾他能使H460和H1975細(xì)胞對(duì)吉非替尼更敏感。其機(jī)制可能與降低H460和H1975細(xì)胞的BRCA1基因表達(dá)有關(guān)，而伏立諾作為EGFR-TKI聯(lián)合用藥的實(shí)際價(jià)值和性價(jià)比仍需要更大樣本的前瞻性的設(shè)計(jì)研究。