劉春齊，萬小云，張耀森，江俊偉

(1.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣東 廣州 511300；2.廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院，廣東 廣州 511300)

IL-27是一種細(xì)胞因子，已被報(bào)道是一種腫瘤抑制基因，在各種癌癥中發(fā)揮著突出的作用，如抑制腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞死亡[1-3]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)病例總數(shù)占全球肺癌病例數(shù)目的一半以上[4]。IL-27在NSCLC中發(fā)揮重要作用，可抑制NSCLC的發(fā)生，但機(jī)制尚不清楚。雖然NSCLC的手術(shù)技術(shù)成熟，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍然很高，中位生存期不到1年，關(guān)于細(xì)胞因子在NSCLC中的作用有大量的報(bào)道[5]。IL-27抑制NSCLC細(xì)胞增殖并增加細(xì)胞凋亡[6-8]。IL-27不僅下調(diào)了與干細(xì)胞和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)的基因，而且在異種移植模型中，IL-27還能促使瘤內(nèi)髓樣細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。IL-27抑制血管內(nèi)皮生長因子、配體8 (C-X-C motif)、配體5 (C-X-C motif)等促血管生成因子在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)[10-11]。miRNAs是非編碼 RNA，大約有20個(gè)核苷酸，并且有結(jié)合目標(biāo)基因的序列[12]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在NSCLC細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用，證實(shí)了其重要的調(diào)節(jié)作用[13]。盡管報(bào)道了IL-27在NSCLC中的作用，但仍然缺乏對(duì)miRNA調(diào)節(jié)的研究。本研究旨在探討IL-27是否能通過miR-935抑制NSCLC細(xì)胞增殖。結(jié)果表明，IL-27可能是通過抑制miR-935表達(dá)來治療NSCLC一種潛在的方法。

1 資料與方法

1.1樣本來源：廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院患者提供NSCLC樣本。15例患者屬于Ⅱ期，Ⅲ期33例，Ⅳ期30例。收集來自患有NSCLC的患者的血液樣品，并使用血清檢測IL-27或miR-935的表達(dá)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)：NSCLC細(xì)胞株(H1299,A549)和正常肺細(xì)胞(BEAS-2B)均購自美國ATCC，培養(yǎng)條件：GIBCO公司生產(chǎn)的DMEM培養(yǎng)基加HyClone公司生產(chǎn)的10%胎牛血清加雙抗(北京索萊寶公司生產(chǎn)的1%青霉素鏈霉素混合液)，在含5% CO2的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR：用Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)的總RNA提取試劑盒分離細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再將得到的cDNA加入 PCR 反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，測定熔解曲線，記錄CT值。并用2-ΔΔCt來確定miRNAs的表達(dá)的水平。該實(shí)驗(yàn)中所用引物購自華大基因 (中國深圳)。

1.3.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：用美國Abcam公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒測定NSCLC患者的血液樣本或轉(zhuǎn)染miR-935的NSCLC細(xì)胞，按廠家提供的ELISA方法和標(biāo)準(zhǔn)測定IL-27蛋白濃度。

表1 引物序列

1.3.3CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：用Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)的細(xì)胞增殖檢測試劑盒用CCK-8法檢測NSCLC細(xì)胞增殖情況。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪2×103個(gè)細(xì)胞。按照說明書上指導(dǎo)的時(shí)間培養(yǎng)后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，細(xì)胞在養(yǎng)箱中溫育2 h。用ELISA法在450 nm處測定吸光度值。

1.3.4MTT法檢測細(xì)胞存活情況：①接種細(xì)胞：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的密度接種到 96 孔板中，每孔液體體積為 200 μl。②培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3 d(可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間)。③呈色：培養(yǎng)3 d后，每孔加 MTT 溶液20 μl (用pH值=7.4的PBS配制為5 mg/ml)。細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，用酶聯(lián)免疫檢測儀OD570 nm(630 nm校準(zhǔn))測量各孔的吸光值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有分析均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢測，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IL-27抑制NSCLC細(xì)胞生長：見圖1。

A：NSCLC細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞IL-27 mRNA水平；B：NSCLC細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞IL-27蛋白水平；C和D：IL-27抑制H1299和A549細(xì)胞增殖圖1 IL-27抑制NSCLC細(xì)胞增殖

研究IL-27在NSCLC細(xì)胞生長中的作用。用細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞進(jìn)行檢測IL-27蛋白表達(dá)，培養(yǎng)NSCLC細(xì)胞，提取總RNA，檢測NSCLC細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞IL-27 mRNA水平，結(jié)果見圖1 A。培養(yǎng)NSCLC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)基收集，使用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測NSCLC細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞IL-27蛋白水平。見圖1 B。結(jié)果表明，BEAS-2B中IL-27的mRNA和蛋白水平均高于A549和H1299 。用IL-27 (10 ng/ml)處理H1299和A549細(xì)胞，采用CCK-8法檢測細(xì)胞，結(jié)果見圖1C、圖1D。結(jié)果表明，IL-27具有抑制H1299和A549細(xì)胞增殖的作用。

2.2miR-935靶向IL-27促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖：探討IL-27在NSCLC細(xì)胞生長中的作用，用miR-935或10 ng/ml的IL-27處理H1299和A549細(xì)胞，然后用MTT法檢測細(xì)胞存活情況。結(jié)果表明IL-27對(duì)H1299和A549細(xì)胞生長有抑制作用，miR-935逆轉(zhuǎn)了由H1299和A549細(xì)胞中的IL-27的作用。見圖2。

圖2 miR-935靶向IL-27促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖

3 討論

IL-27是癌癥抑制因子，其miRNA調(diào)控機(jī)制尚不清楚。該研究發(fā)現(xiàn)，IL-27在NSCLC細(xì)胞中受miRNA調(diào)控。結(jié)果表明，IL-27具有抑制NSCLC細(xì)胞增殖的作用，miR-935調(diào)控了IL-27在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)。IL-27與miR-935的功能關(guān)系表明，miR-935的上調(diào)可直接調(diào)控IL-27表達(dá)，促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖。

IL-27是一種多效雙鏈細(xì)胞因子，由EBI3和IL-27p28亞基組成[2]。IL-27作為異二聚體受體起作用，主要由IL-27Rα(WSX1)和通過STAT1和STAT3的gp130鏈組成[14-15]。IL-27在癌癥中通常起抑癌作用，IL-27是一種免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子，其與IL-12協(xié)同作用，支持CD4+T增殖，T輔助細(xì)胞1型細(xì)胞分化和IFN-γ的產(chǎn)生[2，16]。

IL-27具有潛在的抗腫瘤活性，不僅與誘導(dǎo)腫瘤特異性T輔助細(xì)胞1型和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)，而且與腫瘤細(xì)胞增殖，存活和血管生成潛能的直接抑制作用有關(guān)[17]。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)IL-27能抑制NSCLC細(xì)胞增殖。參與評(píng)估m(xù)iRNA作用的研究顯示，NSCLC中miRNA表達(dá)失調(diào)，并推測其對(duì)惡性腫瘤的重要作用。這些miRNA既可以作為致癌基因，也可以作為腫瘤抑制因子。觀察到miR-10a，miR-200，miR-224，miR-410，miR-27a和miR-320的在NSCLC中表達(dá)下調(diào)，并且miRNA可以抑制細(xì)胞生長。

通過miRNA芯片檢測膀胱癌組織中miR-935上調(diào)。上調(diào)miR-935通過靶向INPP4A促進(jìn)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖[18]。miR-935通過靶向SOX7促進(jìn)肝癌和胃癌細(xì)胞增殖[19]。然而，miR-935通過靶向胃印戒細(xì)胞癌中的Notch1抑制細(xì)胞增殖[20]。報(bào)道的數(shù)據(jù)表明，miR-935在癌癥中具有雙重作用，取決于癌癥的起源。在本研究中發(fā)現(xiàn)miR-935在NSCLC細(xì)胞和組織中升高。miR-935通過靶向IL-27表達(dá)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖。

總之，通過靶向IL-27，MIR935在NSCLC中發(fā)揮致瘤性小RNA的作用。抑制miR-935是一種可能的治療方法。希望IL-27和抑制miR-935的聯(lián)合應(yīng)用是今后治療NSCLC的一種好方法。今后研究小RNA對(duì)IL-27的調(diào)控作用，還需要進(jìn)行更多的探索。