郭 濤，張煥霞，薛 芳，王海鳳，姜艷芳，房文文，林香青，張士永

（山東省水稻研究所/山東省水稻工程技術(shù)研究中心，山東濟南 250100）

水稻是我國最重要的糧食作物之一，種植面積大約占全部耕地面積的1/4，產(chǎn)量大約占糧食總產(chǎn)量的1/2。水稻種子主要由淀粉和蛋白質(zhì)組成，淀粉含量占粒重的75%以上，蛋白質(zhì)含量占粒重的7%～10%。水稻種子儲藏蛋白是以稻米為主食人群的蛋白重要來源，依據(jù)其溶解特性可分為水溶性清蛋白、醇溶性蛋白、鹽溶性球蛋白和可溶于稀酸或稀堿的谷蛋白。水稻種子中谷蛋白是最主要的儲藏蛋白，占稻米總蛋白的60%～80%，是最容易被人體吸收的蛋白[1]。因此，提高谷蛋白含量能增加稻米中可吸收蛋白的含量，提升稻米的營養(yǎng)價值。然而，對于慢性腎臟病患者和并發(fā)腎臟機能損害的糖尿病患者，需要對蛋白質(zhì)的攝入進行嚴格控制，攝入過高的可吸收性蛋白會增加腎臟負擔，加速腎臟功能的衰退，導致病情惡化[2]。近年來，隨著人們生活水平提高和飲食方式突然改變，腎臟病和并發(fā)腎臟機能損害的糖尿病患者人數(shù)的不斷增加，低蛋白含量食品的市場需求越來越大。所以，培育低谷蛋白含量的水稻品種，滿足特殊人群飲食需求，已成為水稻育種的一個熱點[3]。

目前，國內(nèi)多個研究機構(gòu)已利用引進LGC-1 資源材料或新創(chuàng)制的低谷蛋白材料，培育出適合當?shù)胤N植的低谷蛋白水稻新品種（系）。山東省水稻工程技術(shù)研究中心實驗室前期引進了攜帶LGC-1 基因的HNG1種質(zhì)資源，并將該基因定向?qū)氲絻?yōu)良食味米品種圣稻735，培育出谷蛋白含量與資源材料相當?shù)倪m宜黃淮稻區(qū)種植的低谷蛋白水稻新品種[4]。但目前還未有關(guān)于谷蛋白含量降低對稻米淀粉顆粒結(jié)構(gòu)及淀粉RVA譜（rapid viscosity analyzer，RVA）的研究報道。山東省水稻工程技術(shù)研究中心試驗利用前期培育的低谷蛋白水稻新品種圣稻LG03，通過比較其與背景親本圣稻735 的淀粉顆粒結(jié)構(gòu)、淀粉RVA譜特征，以期為闡明谷蛋白含量與淀粉結(jié)構(gòu)及品質(zhì)的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以引自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院種質(zhì)資源庫的低谷蛋白粳稻新品系2054為LGC-1 供體，與本實驗室自育的優(yōu)良食味水稻品種圣稻735 雜交、回交，并結(jié)合分子標記輔助選擇，選育出食味品質(zhì)優(yōu)良的低谷蛋白新品系圣稻LG03[4]。

1.2 圣稻LG03 農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀調(diào)查

試驗于2017年在山東省水稻研究所試驗基地進行。5月11日播種，6月26日移栽。單株材料株行距13 cm×26 cm，每行10株，每個材料種植5 行，用于調(diào)查農(nóng)藝性狀；小區(qū)材料株行距16 cm×26 cm，每穴3～4 苗，小區(qū)面積13.33 m2，每個材料種植3個小區(qū)，用于考察產(chǎn)量。

全區(qū)水稻籽粒90%以上的實粒黃熟為成熟日期，從播種日至成熟日的天數(shù)為全生育期。水稻成熟期隨機選取5個單株，分別考察株高、穗長、主莖穗穗總粒數(shù)、實粒數(shù)，取平均值。脫粒后考察1 000 粒飽滿籽粒的重量，重復兩次，取平均值。分小區(qū)收獲各材料，稱重，測量水分，換算成14.5%含水量重量，取平均值，計算產(chǎn)量。

稻谷收獲后，室溫放置90 d，待品質(zhì)穩(wěn)定后加工成精米，計算精米率（鋒速LTJM160 型精米機，上海青浦綠洲檢測儀器有限公司）；用食味計測定精米蛋白質(zhì)含量和直鏈淀粉含量（RCTA-11A 型，日本佐竹公司），實驗兩次重復，取平均值。稻瘟病抗性由天津市植物保護研究所鑒定。種子總蛋白提取采用SDS-PAGE 分析，具體參照郭濤等[4]實驗方法和步驟。

1.3 淀粉顆粒掃描電鏡觀察

1.3.1 材料準備 將材料加工成精米，夾在開叉的鑷子上，用刀背在樣品的中部施壓，使其自然斷裂，用小刀切下斷裂部分，制成3 mm 厚的樣品，斷面上用IB-23 型離子濺射儀噴鍍金粉；

1.3.2 電鏡觀察 噴金后的斷面用SUPRATM55 熱場發(fā)射掃描電鏡觀察淀粉顆粒形狀及結(jié)構(gòu)，并拍照。電鏡加速電壓為5.0 kV。

1.4 淀粉RVA譜特征測定

將精米研磨成粉末（MM400 型，德國萊馳），過100 目篩子后備用。采用Perten 公司生產(chǎn)的StarchMaster 2 型RVA（rapid viscosity analyzer）快速測定，測定方法參照郭濤等[5]試驗方法和步驟。

1.5 統(tǒng)計分析

表型數(shù)據(jù)均以該性狀的平均值作為最終數(shù)值，用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0 分析軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 圣稻LG03 農(nóng)藝性狀及部分品質(zhì)性狀考察

考察新培育的低谷蛋白品種圣稻LG03 與背景親本圣稻735 的農(nóng)藝性狀，每個材料調(diào)查5 穴，結(jié)果由表1可知，生育期、稻瘟病抗性無顯著差異（P＞0.05），與親本圣稻735 相比，圣稻LG03株高、穗總粒數(shù)、穗實粒數(shù)顯著降低（P＜0.05），而千粒重、折合產(chǎn)量、穗長、直鏈淀粉含量略有升高，精米率、蛋白質(zhì)含量等性狀略有降低，無顯著差異（P＞0.05）。田間觀察長勢一致，無顯著差異。

表1 圣稻LG03 與背景親本圣稻735 的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀比較

2.2 圣稻LG03 蛋白成分測定

圣稻LG03 與圣稻735 籽粒中總蛋白含量差異不大。利用SDS-PAGE 凝膠分析，考察材料儲藏蛋白的組成，結(jié)果如圖1 所示，圣稻LG03 的谷蛋白（包括谷蛋白前體、谷蛋白酸性亞基、谷蛋白堿性亞基）各條帶較背景親本圣稻735 均顯著減少，與供體親本HNG1 相當；圣稻LG03 中的醇溶蛋白比例顯著提高，球蛋白含量略有增加。

2.3 谷蛋白含量降低對淀粉顆粒結(jié)構(gòu)的影響

圣稻LG03 的稻米外觀品質(zhì)與背景親本圣稻735無顯著差異，籽粒外觀表現(xiàn)透明，加工品質(zhì)（糙米率、精米率和整精米率）無明顯變化。利用熱場發(fā)射掃描電鏡在500 倍、1 000 倍和2 000 倍的視野下觀察精米橫斷面的腹部、中部和背部淀粉顆粒形狀及結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2 所示，圣稻LG03 與圣稻735 的胚乳主要由復合淀粉顆粒組成，細胞充實飽滿、無縫隙，淀粉顆粒，多面體，棱角分明，相互鑲嵌，排列緊密；但與圣稻735 相比，圣稻LG03 的淀粉顆粒大小一致性較低，部分淀粉顆粒變小。結(jié)果表明，谷蛋白含量降低，對淀粉顆粒大小的一致性會產(chǎn)生一定的影響。

2.4 谷蛋白含量降低對淀粉RVA譜特征值的影響

由圖3和表2可知，圣稻LG03 的谷蛋白含量降低，淀粉RVA 圖譜整體呈下降趨勢，峰值黏度、熱漿黏度和冷膠黏度均顯著減少。圣稻LG03 的崩解值和糊化溫度降低，說明其淀粉顆粒的高溫穩(wěn)定性降低，這可能與其淀粉顆粒大小一致性降低有關(guān)；回復值和消減值增加，表明淀粉顆粒持水能力降低，回生性增加。到達峰值黏度的時間差異不大。

3 討論

稻米胚乳是人們食用的主要成分，主要由淀粉和蛋白質(zhì)組成。水稻種子儲藏蛋白含量占粒重的7%～10%，是以稻米為主食人群的蛋白重要來源。稻米中儲藏蛋白依據(jù)其溶解特性可分為溶于水的清蛋白（albumins），溶于稀鹽溶液的球蛋白（globulins），溶于醇溶液的醇溶蛋白（prolamins）和溶于稀酸或稀堿溶液的谷蛋白（glutelins）。 谷蛋白占總貯藏蛋白的60%～80%，含量最高，醇溶蛋白占20%～25%，清蛋白和球蛋白含量最低[6]。隨著人們生活水平提高和飲食習慣突變，腎臟病和并發(fā)腎臟機能損害的糖尿病患者越來越多，對于這類腎臟損傷患者而言，攝入過高的蛋白會增加腎臟負擔，導致病情惡化[2]。因此，研究蛋白含量低的水稻新品種，特別是培育容易被人體吸收的谷蛋白含量低的水稻品種，已越來越迫切。

日本科學家利用化學誘變手段得到一個種谷蛋白含量顯著降低的突變體NM67，利用該突變體培育出世界上第一個低谷蛋白含量水稻品種LGC-1，谷蛋白含量低于4%，與正常水稻品種相比，谷蛋白含量明顯降低[7]。國內(nèi)不同學者也利用該資源或新創(chuàng)制資源，培育出多個低谷蛋白含量的水稻新品系（種）。萬建民等[8]利用LGC-1 材料為母本，培育出了國內(nèi)第1個低谷蛋白水稻新品種W3660。陳達剛等[9]利用新培育的W3660 與優(yōu)良秈稻品種雜交、回交，并結(jié)合分子標記輔助選擇，將LGC-1 基因?qū)攵i稻品種五山絲苗，選育出一個農(nóng)藝性狀優(yōu)良的秈型低谷蛋白水稻新品系。郭濤等[4]通過引進資源，將LGC-1 基因定向?qū)雰?yōu)良食味米品種圣稻735，培育出適宜黃淮稻區(qū)種植的低谷蛋白水稻新品系。

表2 谷蛋白含量降低對淀粉RVA譜特征值的影響

蛋白質(zhì)含量與稻米食味品質(zhì)關(guān)系密切。蘭靜等[10]優(yōu)化了稻米蛋白提取方法，發(fā)現(xiàn)蛋白含量相近、食味評分不同的品種谷蛋白電泳譜帶無差異，而清蛋白電泳譜在70～105 kDa 處譜帶存在不同，認為105 kDa是與稻米食味相關(guān)的譜帶，譜帶顏色越深，食味品質(zhì)越好。石呂[11]以一組導入G1 基因和sd1 基因的近等基因系為材料，研究了水稻精米蛋白質(zhì)含量與稻米品質(zhì)變化的關(guān)系，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)含量與食味值呈極顯著負相關(guān)，呈劣化稻米蒸煮食味品質(zhì)的顯著趨勢。

淀粉占水稻胚乳的60%以上，淀粉RVA譜特性是評價稻米品質(zhì)的重要指標，與蒸煮食味品質(zhì)密切相關(guān)。國內(nèi)不同學者就稻米RVA譜特征值與稻米食味品質(zhì)的關(guān)系開展了許多研究[12-13]。舒慶堯等[12]研究認為，稻米的直鏈淀粉含量與消減值、回復值、熱漿黏度和冷膠黏度呈顯著或極顯著正相關(guān)，與崩解值呈顯著負相關(guān)，公認食味較好的優(yōu)質(zhì)品種往往崩解值大，而消減值很小，且多為負值；相反，食味差的品種崩解值往往較小，而消減值很大。胡培松等[13]建立了淀粉RVA 特征值與稻米蒸煮及食味品質(zhì)性狀的回歸定量分析模型，在測定出RVA 特征值后，就可以通過分析軟件自動計算出直鏈淀粉含量和膠稠度的預測值，對稻米蒸煮品質(zhì)及食味品質(zhì)進行快速鑒定。但到目前還未有關(guān)于谷蛋白含量降低對稻米淀粉顆粒結(jié)構(gòu)及淀粉RVA譜特征值影響的相關(guān)報道。本研究中，圣稻LG03 谷蛋白含量顯著降低，導致淀粉RVA譜整體下降，峰值黏度、熱漿黏度、冷膠黏度、崩解值、糊化溫度、到達峰值黏度時間均較圣稻735 減少，而回復值和消減值增加，這可能是由于谷蛋白減少導致的淀粉顆粒大小均勻度降低引起的，雖然電鏡觀察兩者間淀粉顆粒形態(tài)無顯著變化。下一步工作中，需通過考察不同灌漿階段的淀粉顆粒和蛋白體結(jié)構(gòu)，明確谷蛋白減少對淀粉顆粒和蛋白體的影響；考察谷蛋白降低對直鏈淀粉鏈長及支鏈淀粉分支結(jié)構(gòu)的影響，進一步闡明低谷蛋白水稻品質(zhì)變化的機理。

4 結(jié)論

圣稻LG03 與背景親本圣稻735 的農(nóng)藝性狀基本一致，谷蛋白含量顯著降低，淀粉顆粒大小均勻度降低，影響淀粉RVA譜特征值，使圣稻LG03 的峰值黏度、熱漿黏度、冷膠黏度、崩解值、糊化溫度均降低，而回復值和消減值升高，食味品質(zhì)較圣稻735 略有降低。這為闡明谷蛋白含量與淀粉結(jié)構(gòu)及品質(zhì)關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)。

致謝：感謝南京農(nóng)業(yè)大學王益華教授對本實驗儲藏蛋白分析提供的幫助。