饒莉萍， 蘇文瑾， 劉 意， 宋天曉， SOVIGUIDI Deka Reine Judess， 張文英， 楊新筍，①

(1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所， 湖北 武漢 430064； 2. 長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 湖北 荊州 434025； 3. 海南大學(xué)園藝學(xué)院， 海南 ?？?570228)

甘薯〔Ipomoeabatatas(Linn.) Lam.〕是世界第七大糧食作物[1]，富含花青素、胡蘿卜素和類黃酮等多種活性成分[2-3]，具有口感好、保健功效強(qiáng)和供應(yīng)周期長等優(yōu)點(diǎn)，藥用和食用價(jià)值顯著。非生物脅迫是影響甘薯生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因子，如干旱和鹽脅迫可導(dǎo)致甘薯細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損害，破壞其體內(nèi)水分平衡，對甘薯植株的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響，進(jìn)而影響甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。

類黃酮成分具有多種生理功能，廣泛存在于植物的花瓣、花粉、花萼、果實(shí)、種子和莖等組織[5-9]，可調(diào)控植物生長發(fā)育，并在植物應(yīng)對環(huán)境脅迫方面發(fā)揮重要作用[10-13]。查爾酮異構(gòu)酶(CHI，chalcone isomerase)是類黃酮化合物生物合成途徑中較早被發(fā)現(xiàn)的酶之一[14]，而查爾酮異構(gòu)酶基因CHI能夠調(diào)控查爾酮異構(gòu)酶的積累，進(jìn)而影響類黃酮的合成[15-18]，在植物生長發(fā)育、色素積累和抗逆性等方面作用顯著[19-20]。Watkinson等[21]發(fā)現(xiàn)，在干旱條件下栽培馬鈴薯〔Solanumtuberosumssp.andigena(Juz. et Bukasov) Hawkes〕的類黃酮合成途徑相關(guān)酶基因表達(dá)量明顯增加，且在嚴(yán)重或中等干旱條件下不同品系間這些基因的表達(dá)量存在差異，說明類黃酮對馬鈴薯的耐旱性有明顯的影響效應(yīng)；在小麥(TriticumaestvumLinn.)中也獲得了類似的研究結(jié)果[22]。在鹽脅迫條件下，水稻(OryzasativaLinn.)[23]和甘蔗(SaccharumofficinarumLinn.)[24]等作物體內(nèi)一些與類黃酮代謝途徑相關(guān)的基因表達(dá)量上調(diào)。在干旱和鹽脅迫條件下，枳(CitrustrifoliataLinn.)實(shí)生苗的CHI基因表達(dá)量和類黃酮含量均有上調(diào)趨勢[25]；苦蕎〔Fagopyrumtataricum(Linn.) Gaertn.〕的CHI基因表達(dá)量也上調(diào)，顯示苦蕎的抗鹽和抗旱能力增強(qiáng)[26]。

甘薯在生長過程中常面臨高溫和干旱等逆境條件，且其部分種植區(qū)域土壤鹽堿化嚴(yán)重，導(dǎo)致甘薯產(chǎn)量和質(zhì)量下降。通過改變甘薯CHI基因表達(dá)模式，調(diào)控類黃酮在甘薯中的積累，能增強(qiáng)甘薯抗逆性，但關(guān)于CHI基因如何調(diào)控甘薯中類黃酮物質(zhì)積累從而增強(qiáng)其抗逆性目前尚未有明確的研究結(jié)果。鑒于此，作者以甘薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選出1個(gè)與類黃酮積累密切相關(guān)的CHI基因，并從甘薯品種‘福菜薯7-6’(‘Fucaishu 7-6’)葉片中克隆獲得該基因，采用生物信息學(xué)、qRT-PCR及亞細(xì)胞定位等方法分析該基因的結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)特性，以期明確CHI基因與甘薯抗逆性的關(guān)系，為甘薯品種的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的4個(gè)甘薯品種‘EC15’、‘EC16’、‘福菜薯18’(‘Fucaishu 18’)和‘福菜薯7-6’均種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所盆栽場。于2017年7月26日取品種‘福菜薯7-6’成熟葉片約5 g，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存，用于基因克隆；于2019年7月17日取栽植20 d的甘薯品種‘EC15’、‘EC16’、‘福菜薯18’和‘福菜薯7-6’的根、莖、莖尖和葉，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存，用于qRT-PCR分析。

取‘福菜薯18’的胚性愈傷組織，在含1 mg·L-1ABA的MS固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生成試管苗，并繼代至MS固體培養(yǎng)基上，在溫度28 ℃、光照度2 000～3 000 lx、光照時(shí)間16 h·d-1的條件下培養(yǎng)4周；取30株長勢基本一致的完整試管苗，用無菌水洗凈殘留培養(yǎng)基，移至1/2Hoagland溶液中，在上述培養(yǎng)條件下馴化培養(yǎng)3 d；用含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)30%PEG6000和0.2 mol·L-1NaCl的1/2Hoagland溶液分別處理馴化的試管苗，以模擬干旱和鹽處理，各處理15株；在處理的0(對照)、1、6、12和24 h，每個(gè)處理組取3株苗，用液氮速凍并研磨成粉，置于-80 ℃冰箱中保存，用于qRT-PCR分析。

本氏煙草(NicotianabenthamianaDomin)品種‘W38’和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株pCAMBIA1300由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、凝膠回收試劑盒、大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞DH5α、pMD19-T質(zhì)粒載體、LATaq聚合酶、DNA marker DL2000和TransStart?Tip Green qPCR SuperMix試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。CFX96熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD公司，F(xiàn)V3000激光共聚焦顯微鏡購自奧林巴斯(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和IbCHI基因克隆 以‘福菜薯7-6’的葉片為試材，用通用植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1鏈，-20 ℃保存、備用。

在甘薯野生種基因組網(wǎng)站(http：∥sweetpotato.plantbiology.msu.edu/index.shtml)上，利用轉(zhuǎn)錄組測序獲得的Gene ID進(jìn)行檢索，獲得IbCHI基因的編碼區(qū)(CDS)序列。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)該序列的特異性引物，正向引物序列為5′-ATGTCTGCGCCGCCGTG-3′，反向引物序列為5′-CTATTTGGAGACGACCGCTTGTG-3′，采用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得IbCHI基因。

擴(kuò)增體系總體積50.0 μL，包含cDNA模板2.0 μL、2.5 mol·L-1dNTPs 8.0 μL、LATaq聚合酶0.5 μL、10×buffer (Mg2+)5.0 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各1.0 μL以及重蒸水32.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的片段；對回收片段分別進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化以及陽性克隆篩選，送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用NCBI網(wǎng)站(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLASTx功能，檢索與IbCHI基因編碼的氨基酸序列的同源序列，用DNAMAN V6.0軟件對同源氨基酸序列進(jìn)行多重比對；用MEGA 7.0軟件構(gòu)建同源序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(neighbor-joining，bootstrap 1 000)；用ExPASy程序(https：∥web.expasy.org/protparam/)分析IbCHI基因編碼的氨基酸序列的理論相對分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)；用SMART程序(http：∥smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測IbCHI基因編碼的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域；用SOPMA程序(https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL程序(https：∥www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測IbCHI蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；用TMpred程序(https：∥embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)預(yù)測IbCHI蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)用WoLF PSORT程序(https：∥wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測IbCHI蛋白的亞細(xì)胞定位。用PlantCARE程序(http：∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析IbCHI基因5′端上游2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件，并用GSDS 2.0程序(http：∥gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪圖。

1.2.3 qRT-PCR分析 用Primer 3.0程序(https：∥primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)IbCHI基因的熒光定量特異性引物，正向引物IbCHI-Fq序列為5′-GAAAACTGCGTTGCTTTCTGGAAA-3′，反向引物IbCHI-Rq序列為5′-CAAGGGGTGATTGAGTGAAGAAAAT-3′；β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，正向引物序列為5′-AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC-3′，反向引物序列為5′-TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC-3′。參照TransStart?Tip Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

qRT-PCR反應(yīng)體系總體積為20.0 μL，包含cDNA模板3.0 μL、2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix 10.0 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各0.4 μL以及Nuclease-free water 6.2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法[27]計(jì)算各樣品中IbCHI基因的相對表達(dá)量。

1.2.4 重組載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位 以帶有GFP熒光標(biāo)簽的pCAMBIA1300為亞細(xì)胞定位載體，采用雙酶切技術(shù)構(gòu)建IbCHI基因的亞細(xì)胞定位重組載體。從克隆載體上擴(kuò)增IbCHI基因的CDS，正向引物IbCHI-F(KpnⅠ)序列為5′-GGGGTACCATGTCTGCGCCGCCGTG-3′，反向引物IbCHI-R(XbaⅠ)序列為5′-GCTCTAGATTTGGAGACGACCGCTTGTG-3′，同時(shí)利用KpnⅠ和XbaⅠ對pCAMBIA1300-GFP載體進(jìn)行雙酶切，電泳分離后回收目的片段，備用。

將載體與目的片段重組連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。搖菌培養(yǎng)6～8 h后，吸取已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞100 μL，均勻涂抹在含50 mg·L-1卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜；挑選單克隆，PCR驗(yàn)證后測序。利用DNAMAN V6.0軟件進(jìn)行序列分析，保存測序正確的菌液；提取pCAMBIA1300-GFP-IbCHI重組質(zhì)粒，凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，PCR篩選陽性菌液。

采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。在8～9枚葉期(未萌生花芽)的本氏煙草植株上選取生長良好的葉片，將攜帶表達(dá)載體pCAMBIA1300-GFP-IbCHI的根癌農(nóng)桿菌菌液注射至葉片中，置于溫度28 ℃、光照度2 000～3 000 lx、光照時(shí)間16 h·d-1的條件下培養(yǎng)36 h。將侵染后的本氏煙草葉片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用EXCEL 2020和SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表制作。

2 結(jié)果和分析

2.1 IbCHI基因的克隆和生物信息學(xué)分析

2.1.1IbCHI基因克隆分析 以‘福菜薯7-6’cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條全長732 bp的目的片段(圖1)，片段長度與預(yù)期結(jié)果一致，命名為IbCHI基因，編碼IbCHI蛋白。IbCHI基因序列的GC含量為55.19%，共編碼243個(gè)氨基酸；在其氨基酸序列的第12至第214位包含1個(gè)Chalcone結(jié)構(gòu)域(圖2)，說明IbCHI蛋白屬于Chalcone超級(jí)家族。

M： DNA marker； 1： IbCHI基因IbCHI gene.

氨基酸位置 Amino acid position

2.1.2 氨基酸序列的多重比對和同源性分析 多重比對結(jié)果(圖3)顯示：IbCHI基因編碼的氨基酸序列與GenBank中一些植物CHI基因編碼的氨基酸序列相似性存在差異，其中，IbCHI基因編碼的氨基酸序列與同屬種類圓葉牽牛(IpomoeapurpureaLam.)和牽牛〔I.nil(Linn.) Roth〕CHI基因編碼的氨基酸序列相似性較高，均在90%以上；而與其他科種類，如燈籠椒(CapsiumannuumLinn.)、藍(lán)果樹(NyssasinensisOliv.)、芹菜(ApiumgraveolensLinn.)、油橄欖(OleaeuropaeaLinn.)、川黔千金榆(CarpinusfangianaHu)和木犀〔Osmanthusfragrans(Thunb.) Lour.〕等CHI基因編碼的氨基酸序列相似性均在70%以下。

： 同源性100% Homology of 100%； ： 同源性大于或等于75% Homology greater than or equal to 75%； ： 同源性大于或等于50% Homology greater than or equal to 50%； ： 同源性大于或等于33% Homology greater than or equal to 33%.

利用MEGA 7.0軟件對IbCHI基因與其他植物(上述8個(gè)同源性較高的植物)的CHI基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果(圖4)顯示：IbCHI基因與同屬種類圓葉牽牛和牽牛CHI基因編碼的氨基酸序列聚為一支，同源性較高；與其他植物CHI基因編碼的氨基酸序列明顯分離，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?？傮w上看，不同植物種類的CHI蛋白表現(xiàn)出明顯的種屬特性，同科同屬植物的親緣關(guān)系更近。

2.1.3 IbCHI蛋白的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì) 對IbCHI基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測和理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明：IbCHI蛋白分子式為C1156H1831N291O351S7，理論相對分子質(zhì)量為25 646.41，理論等電點(diǎn)為pI 5.25；其氨基酸序列包含24個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基〔精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)〕和27個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基〔天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)〕。氨基酸序列組成中，丙氨酸(Ala)、絲氨酸(Ser)、纈氨酸(Val)和甘氨酸(Gly)所占比例較高，分別為10.3%、9.9%、9.5%和9.1%；半胱氨酸(Cys)所占比例最低，僅為1.2%。IbCHI蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)和總親水性平均系數(shù)分別為38.49和0.074，表明IbCHI蛋白是一種穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6)預(yù)測結(jié)果顯示：IbCHI蛋白含有39.51%的α螺旋、31.69%的隨機(jī)卷曲、20.16%的延伸鏈和8.64%的β轉(zhuǎn)角，他們間次分散在整個(gè)蛋白質(zhì)序列中。在該蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，48%的氨基酸殘基結(jié)構(gòu)置信度達(dá)到88%。

亞細(xì)胞定位和跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果顯示：IbCHI蛋白最可能位于細(xì)胞質(zhì)中，其次是細(xì)胞外、細(xì)胞核、細(xì)胞骨架和高爾基體，且存在1個(gè)跨膜螺旋區(qū)。表明IbCHI蛋白可以進(jìn)行跨膜運(yùn)輸，從而在細(xì)胞核以及細(xì)胞核以外的區(qū)域表達(dá)。

2.1.4IbCHI基因啟動(dòng)子區(qū)功能分析 對IbCHI基因5′端上游2 000 bp啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果(表1和圖7)表明：IbCHI基因啟動(dòng)子序列包含典型的真核生物啟動(dòng)子基本元件TATA-box和CAAT-box，以及脅迫響應(yīng)元件MYB、STRE、W box、MYC和ERE，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif，光響應(yīng)元件G-box、AT-rich element、Box 4、GGA-motif、I-box、LAMP-element、TCT-motif和LTR，晝夜節(jié)律調(diào)控元件circadian，組織特異性表達(dá)元件CAT-box和GCN4-motif，激素響應(yīng)元件ABRE和P-box，植物防御響應(yīng)元件as-1，蛋白質(zhì)代謝調(diào)節(jié)元件O2-site，MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)CCAAT-box和厭氧誘導(dǎo)元件中的類增強(qiáng)因子ARE等26種順式作用元件。

Ib： 甘薯Ipomoea batatas (Linn.) Lam.； Ip： 圓葉牽牛I. purpurea Lam.； In： 牽牛I. nil (Linn.) Roth； Ca： 燈籠椒Capsium annuum Linn.； Ns： 藍(lán)果樹 Nyssa sinensis Oliv.； Ag： 芹菜Apium graveolens Linn.； Oe： 油橄欖Olea europaea Linn.； Cf： 川黔千金榆Carpinus fangiana Hu； Of： 木犀 Osmanthus fragrans (Thunb.) Lour.

氨基酸位置 Amino acid position

圖6 甘薯IbCHI蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

2.2 IbCHI基因的相對表達(dá)量分析

2.2.1IbCHI基因表達(dá)的組織特異性 供試的4個(gè)甘薯品種試管苗的根、莖、莖尖和葉中IbCHI基因的相對表達(dá)量見表2。結(jié)果顯示：IbCHI基因在各品種的根、莖、莖尖和葉中均有表達(dá)，但相對表達(dá)量存在明顯差異，IbCHI基因的相對表達(dá)量在‘福菜薯7-6’的莖中最高、在‘EC15’的莖尖中最低。在‘EC15’根、莖、莖尖和葉中，IbCHI基因的相對表達(dá)量無顯著差異；在‘EC16’中，IbCHI基因在莖和莖尖中的相對表達(dá)量顯著(P<0.05)高于根和葉；在‘福菜薯18’中，IbCHI基因在根中的相對表達(dá)量顯著高于莖、莖尖和葉；在‘福菜薯7-6’中，IbCHI基因在莖中的相對表達(dá)量顯著高于根和莖尖，IbCHI基因在葉中的相對表達(dá)量與其他器官無顯著差異。不同品種間，IbCHI基因在‘福菜薯18’根中的相對表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)品種；IbCHI基因在‘福菜薯7-6’莖和葉中的相對表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)品種；IbCHI基因在各品種莖尖中的相對表達(dá)量存在顯著差異，以在‘EC16’莖尖中最高。說明IbCHI基因在催化類黃酮合成過程中具有組織和品種的特異性。

位置 Position

表2 不同甘薯品種各器官中IbCHI基因的相對表達(dá)量比較

2.2.2 干旱和鹽脅迫對IbCHI基因相對表達(dá)量的影響 采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)30%PEG6000和0.2 mol·L-1NaCl分別模擬干旱和鹽脅迫條件對‘福菜薯18’進(jìn)行0～24 h處理，IbCHI基因相對表達(dá)量的變化見圖8。結(jié)果表明：在干旱和鹽脅迫條件下，IbCHI基因的相對表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長均呈先下降后上升的趨勢(圖8-A，B)。在干旱脅迫條件下，處理1、6和12 h后IbCHI基因的相對表達(dá)量呈上升趨勢，但較對照(處理0 h)顯著降低；處理24 h后IbCHI基因的相對表達(dá)量則顯著升高。在鹽脅迫條件下，處理1、6和12 h后IbCHI基因的相對表達(dá)量較對照有所降低，但無顯著差異；處理24 h后IbCHI基因的相對表達(dá)量則顯著升高。推測在干旱和鹽脅迫24 h后，甘薯體內(nèi)的IbCHI基因應(yīng)激表達(dá)以參與對逆境脅迫的抵御過程。

2.3 IbCHI基因的亞細(xì)胞定位

用IbCHI基因瞬時(shí)表達(dá)載體pCAMBIA1300-GFP-IbCHI和空載體pCAMBIA1300-GFP(對照)分別轉(zhuǎn)化本氏煙草表皮細(xì)胞，并借助綠色熒光蛋白信號(hào)確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布。結(jié)果(圖9)顯示：

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference.

A： 轉(zhuǎn)化空載體pCAMBIA1300-GFP的表皮細(xì)胞(對照) Epidermal cells transformed with empty vector pCAMBIA1300-GFP (the control)； B： 轉(zhuǎn)化IbCHI基因瞬時(shí)表達(dá)載體pCAMBIA1300-GFP-IbCHI的表皮細(xì)胞Epidermal cells transformed with transient expression vector of IbCHI gene pCAMBIA1300-GFP-IbCHI. 1： 綠色熒光視野Green fluorescence field； 2： 明視野Bright field； 3： 重合視野Merged field.

在轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-GFP-IbCHI載體的本氏煙草細(xì)胞內(nèi)，綠色熒光信號(hào)在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中明顯，這一結(jié)果部分印證了IbCHI蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果。

3 討論和結(jié)論

查爾酮異構(gòu)酶(CHI)能夠催化底物查爾酮或6′-脫氧查爾酮分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)，廣泛存在于植物的根、莖、葉和種子中[28-32]。在甘薯品種‘福菜薯7-6’中克隆獲得的IbCHI基因全長732 bp，編碼243個(gè)氨基酸，其氨基酸序列的第12至第214位氨基酸間包含1個(gè)Chalcone結(jié)構(gòu)域，與同屬種類圓葉牽牛和牽牛CHI基因編碼的氨基酸序列相似度達(dá)到90%以上，且在基于CHI基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中也與同屬種類聚在一起，表明在進(jìn)化過程中CHI蛋白的氨基酸序列具有保守性。在IbCHI蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋、延伸鏈、隨機(jī)卷曲和β轉(zhuǎn)角所占比例分別為39.51%、20.16%、31.69%和8.64%，這與吳彥慶等[33]對芍藥(PaeonialactifloraPall.)CHI蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果類似，表明不同物種來源的CHI蛋白在二級(jí)結(jié)構(gòu)上可能具有一定的保守性。

上述研究結(jié)果顯示：IbCHI基因在不同品種甘薯的根、莖、莖尖、葉中均可表達(dá)，但相對表達(dá)量存在明顯差異，說明IbCHI基因的表達(dá)具有組織特異性，這可能與甘薯不同部位類黃酮的積累和分布差異有關(guān)[34]；IbCHI基因的相對表達(dá)量在甘薯不同品種間也存在差異，與甘薯各品種的基因型不同有關(guān)，導(dǎo)致IbCHI基因的表達(dá)具有品種間的差異性。在干旱(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)30%PEG6000)和鹽(0.2 mol·L-1NaCl)條件下處理0～24 h，IbCHI基因的相對表達(dá)量總體上明顯升高，說明該基因的表達(dá)與甘薯對非生物脅迫抗性的調(diào)控相關(guān)。在IbCHI基因啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控元件中包含多個(gè)逆境響應(yīng)元件，這也佐證了該基因參與了對逆境脅迫的抵御過程。

植物的類黃酮代謝是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，受到多種酶的綜合調(diào)控。高等植物抵抗逆境的過程非常復(fù)雜，本研究僅對甘薯品種‘福菜薯7-6’IbCHI基因進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析，但I(xiàn)bCHI基因?qū)Ω适眢w內(nèi)類黃酮代謝的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究，有關(guān)甘薯IbCHI基因表達(dá)與其抗逆性的關(guān)系還需從生理生化等方面進(jìn)行深入研究。