代萬武，黃祖權(quán)，張波，杜勇軍，李興艷

山姜素（alpinetin）是從傳統(tǒng)中藥中提取的小分子藥物，來源廣泛，具有較高的藥用價(jià)值和開發(fā)價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)山姜素具有抗菌、抗氧化、抗癌、降血壓、降血脂、降血糖、止吐、鎮(zhèn)痛等作用［1］。山姜素可以抑制炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展，如在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜炎的小鼠模型中，山姜素可以通過減輕子宮的組織學(xué)病變和降低髓過氧化物酶（MPO）的活性來保護(hù)小鼠免受子宮內(nèi)膜炎侵害［2］。在LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷模型中，山姜素可以抑制腎組織中炎性因子如腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β 和IL-6 的產(chǎn)生，同時(shí)還可以通過抑制Toll 樣受體（TLR）4 的表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB 的活化來減輕腎臟損傷［3］。但是，有關(guān)山姜素對骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）中軟骨細(xì)胞作用的研究較少。本研究通過LPS 構(gòu)建OA 中的軟骨細(xì)胞損傷模型，旨在觀察山姜素在OA 治療中的作用，為小分子中藥治療OA提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD乳鼠5只，3～5 d，體質(zhì)量（4±2）g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號SCXK（桂）2014-0002。

1.2 主要試劑與儀器 山姜素購自Sigma-Aldrich 公司，Eagle培養(yǎng)基、二甲基亞砜（DMSO）、CCK-8試劑盒、熒光素二乙酸酯/碘化丙啶（FDA/PI）購自Solarbio 公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）試劑盒、RNA提取試劑盒、RNA分離試劑盒購自Megentec 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas 公司，免疫熒光抗體、免疫熒光染料FITC購自博士德公司，Ⅱ型膠原酶（Col2a1）、胰蛋白酶、活死細(xì)胞染色試劑盒、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液購自Gibco 公司，酶標(biāo)儀購自Thermo Scientific MultiskanGO 公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，Light Cycle 96儀器購自瑞士Roche公司。

1.3 軟骨細(xì)胞的提取、分離和培養(yǎng) 于SD 乳鼠的膝關(guān)節(jié)處分離提取原代軟骨細(xì)胞后純化培養(yǎng)。具體步驟：將乳鼠過量麻醉致死，在超凈臺用無菌器械獲取乳鼠四肢關(guān)節(jié)處的軟骨組織，并剪成小顆粒后用胰蛋白酶在37 ℃下消化30 min，生理鹽水清洗3 遍后采用2 g/L 的Col2a1 置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化4 h后，重懸，取上清離心（1 000 r/min，5 min），收集細(xì)胞，在含10%（V/V）胎牛血清和1%（V/V）青霉素/鏈霉素的改良Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代。根據(jù)細(xì)胞生長形態(tài)，每1～2 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8 法檢測軟骨細(xì)胞活性 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按5×103/孔的密度將軟骨細(xì)胞接種在96孔板中，將提取的軟骨細(xì)胞分為對照組、LPS 誘導(dǎo)組（模型組）和LPS 誘導(dǎo)后加山姜素處理組（山姜素組）。所有組別均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁。模型組和山姜素組中加入10 mg/L的LPS誘導(dǎo)1 h，構(gòu)建軟骨細(xì)胞損傷模型［4］，隨后山姜素組中分別加入0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、30、40、50 mg/L 山姜素，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后每孔各加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2～4 h。酶聯(lián)免疫法檢測450 nm波長處每個(gè)孔的吸光度。

1.5 FDA/PI染色觀察軟骨細(xì)胞的存活 取對數(shù)生長期的軟骨細(xì)胞，消化離心計(jì)數(shù)后按1.5×104種植在含爬片的24 孔板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁，加入LPS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷，再加5 mg/L 山姜素處理培養(yǎng)24 h 后，用現(xiàn)配的FDA/PI 染液（在1 mL PBS中分別加入0.5 μL FDA和2 μL的PI，混勻）室溫孵育5 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min，在熒光顯微鏡下觀察拍照、記錄分析。

1.6 qPCR 檢測 根據(jù)試劑盒步驟提取各組細(xì)胞總RNA，測定提取RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA再進(jìn)行qPCR反應(yīng)，檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）、Col2a1的mRNA 表達(dá)水平，引物序列見表1。每個(gè)組別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃10 min，40 ℃10 s，60 ℃60 s，40個(gè)循環(huán)。按照2-ΔΔCt方法計(jì)算不同組別的mRNA相對表達(dá)量，重復(fù)3次。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR所用引物系列

1.7 免疫熒光分析軟骨細(xì)胞中IL-6的表達(dá) 將軟骨細(xì)胞按2.0×104接種在含爬片的24孔板中，培養(yǎng)24 h等待細(xì)胞貼壁。LPS 誘導(dǎo)炎癥環(huán)境，按照對照組、模型組和山姜素組處理24 h，PBS沖洗3次后用無水乙醇固定15～30 min，PBS洗3次，每次5 min，待用。將準(zhǔn)備好的細(xì)胞爬片在室溫環(huán)境下用3%的H2O2孵育10～15 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min；室溫條件下山羊血清孵育10～15 min，棄掉山羊血清，注意勿洗；再用IL-6一抗稀釋液（1∶200）4 ℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次，每次3 min；然后，滴加Cy3-羊抗兔IgG二抗稀釋液（1∶200），室溫避光孵育1 h，PBS沖洗3次，每次3 min；加入DAPI染液，避光孵育15 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min。細(xì)胞爬片防淬滅劑封片后熒光顯微鏡下觀察拍片、記錄分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0和Graph pad 8.0軟件對各實(shí)驗(yàn)的結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間數(shù)據(jù)用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。2 組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山姜素處理對LPS 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活性的影響 模型組的吸光度（0.55±0.04）較對照組（0.65±0.03）降低（n=3，t=3.896，P＜0.05）。當(dāng)采用劑量為5 mg/L的山姜素處理時(shí)，吸光度最高（n=3，F(xiàn)=5.321，P＜0.05）；當(dāng)劑量＞5 mg/L時(shí)，軟骨細(xì)胞的吸光度并未隨之增加。因此選擇5 mg/L的山姜素劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，見圖1。

Fig.1 CCK-8 assay was used to detect the effect of alpinetin on the activity of LPS-induced chondrocytes.圖1 CCK-8法檢測山姜素組山姜素對LPS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的活性的影響

2.2 FDA/PI 染色檢測山姜素對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用 與對照組比較，模型組的死細(xì)胞數(shù)量增加，活細(xì)胞數(shù)量減少；與模型組比較，山姜素組死細(xì)胞數(shù)量減少，活細(xì)胞數(shù)量增加，見圖2。

Fig.2 FDA/PI staining was used to detect the effect of alpinetin on chondrocytes cells(×200)圖2 FDA/PI染色檢測山姜素對軟骨細(xì)胞的作用（×200）

2.3 山姜素對Col2a1、IL-1β、IL-6、iNOS、TNF-α、MMP-13mRNA 的調(diào)控 與對照組相比，模型組Col2a1mRNA 表達(dá)降低，IL-1β、IL-6、iNOS、TNF-α、MMP-13mRNA 表達(dá)均顯著增高（P＜0.01）；山姜素組Col2a1mRNA 較模型組增高，IL-1β、IL-6、iNOS、TNF-α和MMP-13mRNA的表達(dá)水平較模型組降低（P＜0.01），見表2。

Tab.2 Comparison of the mRNA expression levels of inflammatory factors between 3 groups表2 3組炎性因子mRNA表達(dá)水平的比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of the mRNA expression levels of inflammatory factors between 3 groups表2 3組炎性因子mRNA表達(dá)水平的比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組山姜素組F Col2a1 1.00±0.05 0.45±0.03a 0.51±0.02ab 223.178＊＊IL-1β 1.03±0.35 75.60±1.88a 47.31±6.01ab 320.901＊＊IL-6 1.09±0.49 14.90±1.34a 9.56±0.90ab 153.828＊＊組別iNOS TNF-α MMP-13對照組模型組山姜素組F 1.05±0.41 716.00±22.71a 459.57±18.85ab 1 355.398＊＊1.01±0.63 118.99±11.65a 87.87±3.08ab 231.096＊＊1.00±0.14 12.61±0.20a 9.52±0.26ab 2 521.162＊＊

2.4 免疫熒光檢測各組軟骨細(xì)胞中IL-6 的表達(dá) 與對照組比較，模型組中IL-6 表達(dá)水平增高；與模型組比較，山姜素組中IL-6 表達(dá)水平降低，見圖3。

Fig.3 Immunofluorescence analysis of the regulation of alpinetin on IL-6 expression in chondrocytes cells(×200)圖3 免疫熒光分析山姜素對軟骨細(xì)胞IL-6表達(dá)的調(diào)控（×200）

3 討論

OA是由多種因素引起的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，涉及關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、軟骨下骨等組織，在中老年人中最常見并嚴(yán)重影響其健康和生活質(zhì)量［5-6］。疾病早期大量炎性因子（如IL-1β、MMP-13和TNF-α）的過量表達(dá)和關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解［7］導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨局部代謝紊亂，破壞軟骨細(xì)胞DNA 的合成以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞損傷以及軟骨下骨重塑，最終形成OA。

OA的主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)摩擦感或摩擦音、僵硬、運(yùn)動受限等。目前OA 的治療目標(biāo)是減輕疼痛癥狀,矯正關(guān)節(jié)畸形和改善關(guān)節(jié)活動功能。治療方法主要包括阿片類鎮(zhèn)痛劑和非甾體類抗炎藥物治療,關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉物理治療以及全（半）關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療［8］。然而，這些藥物和治療手段只能減輕疼痛，并不能阻止OA 的進(jìn)展。因此，在早期進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)，減緩關(guān)節(jié)軟骨的退化是延緩OA進(jìn)一步發(fā)生發(fā)展的理想策略。

山姜素是一種從天然植物中提取的類黃酮單分子藥物，具有良好的抗菌、抗氧化作用。研究表明，山姜素可通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）/NF-κB 信號通路抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷中炎性介質(zhì)的產(chǎn)生［9］。He 等［10］證實(shí)山姜素可通過TLR4 信號通路降低葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎相關(guān)炎性指標(biāo)的表達(dá)。本研究旨在探討山姜素對LPS 誘導(dǎo)的OA 模型的軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果表明山姜素能夠有效地抑制LPS 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷。關(guān)節(jié)軟骨的主要成分是軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，其中膠原是細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分，Col2a1 在其中起著軟骨支架結(jié)構(gòu)的重要作用［11］。在山姜素組中Col2a1的基因表達(dá)較模型組增高，說明山姜素還可以通過促進(jìn)Ⅱ型膠原的表達(dá)來保護(hù)軟骨細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1 可以通過蛋白激酶/調(diào)節(jié)激酶/特異性蛋白1（MEK/ERK/Sp1）信號通路來促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的降解，并增強(qiáng)關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)重塑［12］。此外，在OA 關(guān)節(jié)滑液和關(guān)節(jié)軟骨中能夠檢測到IL-6的表達(dá)，這表明IL-6參與OA的發(fā)生發(fā)展過程［13］。IL-1β和TNF-α是OA的關(guān)鍵促炎介質(zhì)，同時(shí)TNF-α 對MMP-3 有較強(qiáng)的刺激作用［14］。此外，在OA 中，MMP-13 的高表達(dá)會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解［15］。另有研究報(bào)道，抑制MMPs 的表達(dá)可以延緩關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)展。在本研究中，山姜素組中的MMP-13的表達(dá)較模型組顯著降低，并較好地維持了細(xì)胞的形態(tài)并促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖，進(jìn)而保護(hù)軟骨細(xì)胞。一氧化氮（NO）已被確定為OA中的主要炎性介質(zhì)之一，在OA的發(fā)展和進(jìn)程中驅(qū)動多種病理變化。軟骨細(xì)胞中NO 的過量產(chǎn)生會導(dǎo)致軟骨破壞和細(xì)胞損傷，iNOS催化軟骨細(xì)胞中NO 的合成［16］，因此iNOS 的表達(dá)水平在一定程度上反映了軟骨細(xì)胞的損傷情況。在本研究中，模型組中的炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS）的表達(dá)水平顯著增加，山姜素組中的各項(xiàng)炎性因子明顯減少。

綜上所述，山姜素能夠通過抑制炎癥軟骨細(xì)胞中炎性因子IL-1β、iNOS、IL-6、TNF-α 及MMP-13的表達(dá)來維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，并促進(jìn)Col2a1 的表達(dá)，表明山姜素可能是治療骨性關(guān)節(jié)炎的一種可選擇的藥物，但有關(guān)山姜素保護(hù)軟骨細(xì)胞的具體細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還需進(jìn)一步探討。