張 怡 韓永紅 徐慧麗

胃癌(gastric cancer，GC)作為一種常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率分別位居所有惡性腫瘤的第5位和第3位[1]。中國作為GC高發(fā)國家，發(fā)病和死亡例數(shù)均約占全世界的50%[2]。GC的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移是一個多基因參與的多階段、多步驟復(fù)雜過程，其中，原癌基因和抑癌基因的失調(diào)在其中扮演著重要角色[3]。Sirtuins (SIRTs)作為一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)+依賴的去乙?；讣易?，廣泛參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程，其異常表達(dá)與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。SIRT4作為去乙酰化酶家族中特征最不明顯的成員之一，在乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌和膀胱癌等多種實體惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，扮演抑癌基因的角色[5]。然而，關(guān)于SIRT4在GC中的臨床預(yù)后價值仍需進(jìn)一步探索。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2013年10月至2014年10月期間在我院住院并接受手術(shù)治療的113例GC患者的組織標(biāo)本。入組標(biāo)準(zhǔn):①所有病例均經(jīng)組織病理學(xué)確診為胃癌；②術(shù)前未接受過任何形式的抗腫瘤治療；③根據(jù)NCCN指南推薦，對術(shù)后病理分期為ⅡB和Ⅲ期的患者進(jìn)行術(shù)后輔助治療；④具有完整的臨床病理資料和5年隨訪信息。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①術(shù)前已轉(zhuǎn)移、接受姑息性切除的患者；②排除5年內(nèi)有其他惡性腫瘤既往史者。納入患者的平均年齡為(63.65±9.01)歲，患者的術(shù)后病理分期采用國際抗癌協(xié)會(Union for International Cancer Control,UICC)第7版腫瘤分期系統(tǒng)。本研究在標(biāo)本收集時已獲武漢市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)并獲得所有患者簽署的書面知情同意。

1.2 免疫組化染色

取組織石蠟切片置于恒溫箱中烘烤脫蠟，再置于二甲苯中脫蠟2次，酒精梯度水化后，3% H2O2去離子水(無色液體)孵育10～30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。山羊血清封閉15～30 min，孵SIRT4一抗(1∶200稀釋，美國Abcam公司)，4 ℃過夜，次日滴加標(biāo)記有HRP的二抗(山羊抗兔二抗，武漢賽維爾生物科技有限公司)，室溫孵育30 min，顯色劑顯色(DAB)，顯微鏡下控制反應(yīng)時間。蘇木精復(fù)染，逐級脫水、透明、中性樹膠封片染色。然后在奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行閱片和結(jié)果判定。

1.3 免疫組化結(jié)果評分

根據(jù)染色強(qiáng)度及細(xì)胞陽性百分率進(jìn)行讀片。染色強(qiáng)度：0分(陰性，無著色)，1分(弱陽性，淡黃色)，2分(中等強(qiáng)度，黃色)和3分(強(qiáng)陽性，棕黃色或褐色)；陽性細(xì)胞百分率：0分(≤5%)，1分(>5%～25%)，2分(>25%～50%)，3分(>50%～75%)，4分(>75%)。兩項評分的乘積為最終的評分，總分≤3分定義為低表達(dá)，>3分定義為高表達(dá)。

1.4 臨床資料收集整理

通過查閱患者病歷檔案，收集患者臨床病理信息，包括性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴脈管浸潤、神經(jīng)侵犯、術(shù)前CEA水平及TNM分期等。采用電話隨訪或門診復(fù)診的方式自手術(shù)當(dāng)日起進(jìn)行隨訪，截止時間為2019年9月30日，納入患者均完成5年隨訪。記錄患者總生存期(overall survival，OS)。OS定義為自患者確診之日至患者死亡或最后1次隨訪日期。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗。Kaplan-Meier法分析生存率并繪制生存曲線，組間生存差異比較采用Log-rank檢驗。采用單因素分析探究影響患者總生存期的危險因素，有顯著意義的因子納入Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT4在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平

免疫組化檢測顯示：SIRT4表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，其在GC組織和癌旁組織中均有表達(dá)，在癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度顯著低于癌旁組織。免疫組化結(jié)果評分：腫瘤組織及癌旁組織SIRT4評分分別為(2.138±1.306)分、(9.582±3.23)分，腫瘤組織評分顯著低于癌旁組織(t=23.031，P<0.001)。

2.2 SIRT4表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

SIRT4在73例GC組織中呈低表達(dá)，低表達(dá)率為62.39%(73/117)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GC組織中SIRT4低表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴脈管浸潤、神經(jīng)侵犯及TNM分期顯著相關(guān)(P均<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小及術(shù)前CEA水平無顯著相關(guān)性(P均>0.05)，見表1。

2.3 SIRT4表達(dá)與胃癌患者總生存期的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗結(jié)果顯示，低表達(dá)SIRT4組的GC患者的總體生存率顯著低于高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，見圖1。

2.4 影響胃癌患者預(yù)后的危險因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴脈管浸潤、神經(jīng)侵犯、TNM分期及SIRT4表達(dá)水平是影響GC患者OS的危險因素(均P<0.05)，見表2；進(jìn)一步多因素Cox比例風(fēng)險模型分析表明，TNM分期及SIRT4表達(dá)水平是影響患者OS的獨立危險因素(均P<0.05)，見表2。

表1 胃癌組織中SIRT4表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

圖1 胃癌組織中SIRT4表達(dá)水平與患者總生存期的關(guān)系

3 討論

由于早診早治理念的缺乏及早篩技術(shù)的低普及，我國大部分GC患者在確診時已處于進(jìn)展期，手術(shù)、放化療及分子靶向治療技術(shù)的進(jìn)步在一定程度上提升了GC的治療效果，但患者的臨床預(yù)后仍不盡如人意[6]。目前，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致GC患者死亡的首要原因[3,7]。目前研究表明，GC的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移是一個多基因、多條信號通路參與的復(fù)雜過程，然而，GC的具體發(fā)病原因仍不明確[7]。因此，有必要進(jìn)一步探究GC發(fā)生發(fā)展過程中涉及的基因表達(dá)改變，從而為尋找胃癌新的治療靶點提供理論依據(jù)。

SIRT4是1種位于線粒體上的ADP核糖轉(zhuǎn)移酶，能通過抑制谷氨酰胺脫氫酶的活性而抑制細(xì)胞內(nèi)的谷氨酰胺代謝途徑，從而發(fā)揮抑癌基因的功能[5]。既往研究表明，SIRT4在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)[5,8-9]。Miyo等研究發(fā)現(xiàn)，SIRT4在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低，其表達(dá)水平與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴脈管浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期呈顯著負(fù)相關(guān)，同時，生存分析顯示低表達(dá)患者的無復(fù)發(fā)生存時間顯著縮短[8]；Nakahara等研究發(fā)現(xiàn)SIRT4在食管癌組織中低表達(dá)，其表達(dá)水平與患者的臨床病理學(xué)參數(shù)無明顯相關(guān)性，但SIRT4低表達(dá)患者的無病生存期和總生存期顯著縮短，進(jìn)一步多因素分析顯示SIRT4低表達(dá)是影響食管癌患者預(yù)后的獨立因素[9]；Gong等通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，SIRT4在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，且SIRT4高表達(dá)預(yù)示著更長的生存時間[10]。本研究結(jié)果表明，SIRT4在GC組織中表達(dá)顯著低于配對的癌旁組織；臨床病理分析發(fā)現(xiàn)，SIRT4低表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴脈管浸潤、神經(jīng)侵犯及TNM分期顯著相關(guān)等不良臨床病理特征呈顯著負(fù)相關(guān)；進(jìn)一步的臨床預(yù)后分析提示，SIRT4低表達(dá)患者的總生存期顯著縮短，且是影響GC患者預(yù)后的獨立危險因素。上述研究結(jié)果提示，SIRT4可能在GC的發(fā)生發(fā)展中扮演抑癌基因的角色。結(jié)合既往相關(guān)研究結(jié)果推測，SIRT4可能在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑制作用，其通過延緩腫瘤的進(jìn)展而改善患者的預(yù)后。

目前，關(guān)于SIRT4在腫瘤中的功能及其抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制的相關(guān)研究仍較少。Jeong等發(fā)現(xiàn)SIRT4可通過抑制線粒體的谷氨酰胺代謝，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對DNA損傷的代謝反應(yīng)，從而發(fā)揮抑癌活性[11]。Miyo等的研究表明，SIRT4可通過抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的谷氨酰胺代謝調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[8]。Csibi等發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT4能抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD-1和人前列腺癌細(xì)胞株DU145的增殖能力[12]。在GC中，Sun等研究證實，SIRT4可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[13]；此外，Huang等研究表明，SIRT4可通過下調(diào)p-ERK、cyclin D和cyclin E的表達(dá)水平，導(dǎo)致GC細(xì)胞的G1周期阻滯，進(jìn)而抑制其增殖能力[14]。據(jù)此，我們推測SIRT4可通過抑制GC細(xì)胞的谷氨酰胺代謝和EMT進(jìn)程，影響腫瘤細(xì)胞的周期、增殖、侵襲及遷移等生命活動，從而發(fā)揮其抑癌活性。

表2 影響胃癌患者總生存期風(fēng)險因素的單因素和多因素分析

綜上，SIRT4在GC中表達(dá)顯著下調(diào)，且其低表達(dá)與患者的不良臨床病理特征密切相關(guān)，預(yù)示著患者的不良預(yù)后。本研究結(jié)果提示SIRT4能夠成為GC患者預(yù)后評估的重要生物標(biāo)志物，也有望成為一個潛在的GC治療靶點。然而，關(guān)于SIRT4抑制GC發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制仍不清楚，需在后續(xù)的研究中加以闡明。