王 惠 王 飛 楚瑞雪 盧躍兵 孫 爽 孫先桃

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤屬于一種眼內(nèi)惡性腫瘤，嬰幼兒是高發(fā)人群[1-3]。近年來(lái)，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患病率日益上升[4-6]，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確，故本研究主要探討抑制Pax6基因表達(dá)對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤增殖侵襲的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2015年5月至2019年5月我院視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患兒30例，其中男性11例，女性19例，年齡3個(gè)月至5歲，平均(3.1±1.0)歲。將患兒視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織及瘤旁組織保存下來(lái)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；②均符合視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；③均具有良好的依從性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受放化療治療；②合并其他嚴(yán)重疾??；③合并精神病史。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑與儀器 購(gòu)買(mǎi)中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HXO-RB44，美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)的RPMI 1640培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶，碧云天生物技術(shù)研究所提供的CCK8試劑盒、BCA試劑盒，美國(guó)Millipore公司生產(chǎn)的Transwell小室，日本TaKaRa公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒，美國(guó)abcam公司生產(chǎn)的ki67、Pax6、磷酸化絲氨酸蘇氨酸激酶(p-AKT)抗體、磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)，德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)的PCR擴(kuò)增儀，Bio-Rad公司生產(chǎn)的酶標(biāo)儀，日本OLYMPUS公司生產(chǎn)的倒置顯微鏡。

1.3.2 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中Pax6基因表達(dá)的RT-PCR檢測(cè) 在預(yù)冷的研缽中研磨視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織及瘤旁組織成粉末，將組織中的總RNA提取出來(lái)，在此過(guò)程中嚴(yán)格依據(jù)Trizol說(shuō)明書(shū)，對(duì)提取的總RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，在此過(guò)程中采用紫外分光光度計(jì)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在此過(guò)程中應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。對(duì)內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、目的基因Pax6的RT-PCR引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，在此過(guò)程中采用Oligo 7.0軟件。將內(nèi)參設(shè)定為GAPDH，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀定量Pax6基因表達(dá)。GAPDH、Pax6引物序列具體見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件為在95 ℃、95 ℃、57 ℃、72 ℃的溫度下分別進(jìn)行5 min、30 s、30 s、20 s的反應(yīng)，共40個(gè)循環(huán)。最后在72 ℃的溫度下進(jìn)行15 min的延伸，保存在4 ℃的溫度下。設(shè)置每個(gè)樣品6個(gè)重復(fù)，將Pax在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中mRNA相對(duì)表達(dá)量計(jì)算出來(lái)，在此過(guò)程中運(yùn)用2-△△Ct法。

表1 GAPDH、Pax6引物序列[8]

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將在液氮中保存的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HXO-RB44取出來(lái)，在37 ℃水浴中以較快的速度溶解，然后在RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(含青鏈霉素雙抗、10%胎牛血清)中放置溶解后的細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，飽和適度為95%。進(jìn)行2～3次穩(wěn)定傳代后，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞取出來(lái)，在實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用。轉(zhuǎn)染前1 d在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，每孔2 ml，濃度為1×106個(gè)/孔，轉(zhuǎn)染前保證細(xì)胞生長(zhǎng)密度在90%以上，分為Pax6沉默組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組3組，每組10例，分別轉(zhuǎn)染Pax6-siRNA、NC-siRNA、不經(jīng)任何處理。依據(jù)LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染說(shuō)明(美國(guó)Invitrogen公司)進(jìn)行整個(gè)轉(zhuǎn)染過(guò)程。

1.3.4 轉(zhuǎn)染效果分析 將3組轉(zhuǎn)染后2 d的細(xì)胞取出來(lái)，將肝細(xì)胞中的總蛋白提取出來(lái)，在此過(guò)程中應(yīng)用RIPA試劑盒，將少量蛋白樣品取出來(lái)，定量提取的蛋白，在此過(guò)程中應(yīng)用BCA試劑盒，充分混合蛋白樣品與上樣緩沖液后，放置在100 ℃沸水中，進(jìn)行5 min的變性，將40 μg蛋白樣品加入到每孔中，在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中分離，完成電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉，將一抗設(shè)定為1∶400稀釋的Pax6、1∶1000稀釋的GAPDH，在4 ℃的溫度下孵育過(guò)夜，用TBST洗膜3次，每次5 min，將羊抗鼠IgG(1∶1000稀釋?zhuān)备^(guò)氧化物酶標(biāo)記)加入，室溫下進(jìn)行1 h的孵育，洗膜，在此過(guò)程中將TBST充分利用起來(lái)，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光劑顯色，在此過(guò)程中運(yùn)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)，室溫避光環(huán)境下顯影、定影。將內(nèi)參設(shè)定為GAPDH，對(duì)Pax蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.3.5 細(xì)胞增殖分析(CCK8法) 將3組轉(zhuǎn)染后2 d的細(xì)胞取出來(lái)，將10 μl CCK8試劑加入到每孔細(xì)胞中，在37 ℃、5%CO2中進(jìn)行2 h繼續(xù)培養(yǎng)。在450 nm波長(zhǎng)處對(duì)各個(gè)孔的吸光度(A)值進(jìn)行測(cè)定，在此過(guò)程中采用酶標(biāo)儀，將細(xì)胞增殖率計(jì)算出來(lái)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞A的百分率即為細(xì)胞增殖率。

1.3.6 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)(Transwell小室) 在培養(yǎng)小室的濾膜上鋪上Matrigel膠，將100 μl加入到每孔中，在37 ℃的溫度下進(jìn)行1 h的放置，充分凝固，在此過(guò)程中將Matrigel膠充分利用起來(lái)，調(diào)整3組轉(zhuǎn)染培養(yǎng)2 d的細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，將200 μl細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室中，將RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)加入到下室中，1 d后將膜上層細(xì)胞擦去，室溫下進(jìn)行30 min固定，在此過(guò)程中將甲醛充分利用起來(lái)，用蘇木精染色。顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀(guān)察，將6個(gè)不同視野(×200)隨機(jī)取出來(lái)，進(jìn)而對(duì)穿膜的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行觀(guān)察，試驗(yàn)重復(fù)3次，從而將侵襲細(xì)胞的平均數(shù)計(jì)算出來(lái)。

1.3.7 ki-67、PI3K、MMP-2、p-AKT蛋白表達(dá)檢測(cè) 取3組轉(zhuǎn)染后2 d的細(xì)胞，提取細(xì)胞中的蛋白，運(yùn)用免疫組化法對(duì)ki-67、PI3K、MMP-2、p-AKT蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤及瘤旁組織中Pax6 mRNA基因表達(dá)比較

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中Pax6基因mRNA表達(dá)為(4.656±0.012)，顯著高于瘤旁組織的(0.926±0.080),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=78.751,P<0.05)。

2.2 3組Pax6蛋白相對(duì)表達(dá)量、HXO-RB44細(xì)胞存活率、侵襲數(shù)比較

Pax6沉默組Pax6蛋白相對(duì)表達(dá)量、HXO-RB44細(xì)胞存活率均顯著低于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組(P<0.05)，HXO-RB44細(xì)胞侵襲數(shù)均顯著少于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組(P<0.05)，但陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組Pax6蛋白相對(duì)表達(dá)量、HXO-RB44細(xì)胞存活率、侵襲數(shù)之間的差異均不顯著(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組Pax6蛋白相對(duì)表達(dá)量、HXO-RB44細(xì)胞存活率、侵襲數(shù)比較

2.3 3組ki-67、PI3K、MMP-2、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

Pax6沉默組ki-67、PI3K、MMP-2、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著低于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組(P<0.05)，但陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組ki-67、PI3K、MMP-2、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量之間的差異均不顯著(P>0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

表3 3組ki-67、PI3K、MMP-2、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖1 3組ki67、MMP-2、PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)

3 討論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)，是一種罕見(jiàn)的癌癥形式，從視網(wǎng)膜的未成熟細(xì)胞即眼睛的光檢測(cè)組織迅速發(fā)展而來(lái)。它是兒童中最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性眼內(nèi)癌，幾乎全部見(jiàn)于幼童。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤起源于胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞的惡性腫瘤，它的發(fā)病病因不是很清楚，可能和染色體異?；蛘呤歉腥居嘘P(guān)。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是治愈率最高的癌癥之一，95%～98%的患病兒童能夠康復(fù)，并且超過(guò)90%的患兒能存活至成年以后。從這個(gè)概率上來(lái)講，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤沒(méi)有那么恐怖，致死是小概率的，但部分患兒可能會(huì)失去視力，或者需要摘除眼球。

目前發(fā)達(dá)國(guó)家已較少采取摘除眼球的治療方法，而是采用一些保眼療法，力爭(zhēng)保存有用視力。當(dāng)腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高、腫瘤體積超過(guò)眼球的一半時(shí)，保眼治療無(wú)法控制時(shí)要考慮眼球摘除。目前已經(jīng)確定視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生是由染色體缺失或者基因突變引起的。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，當(dāng)RB1基因(腫瘤抑制基因)發(fā)生變異或者缺失，就無(wú)法產(chǎn)生正常的pRB(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白)，視網(wǎng)膜母細(xì)胞就會(huì)不停地增殖，無(wú)法分化成正常的視網(wǎng)膜細(xì)胞，從而產(chǎn)生視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。此遺傳為常染色體顯性遺傳，外顯率約為90%，此處需要注意的是外表正常的父母，如果生育有Rb患兒，說(shuō)明該父母有可能為Rb基因攜帶者。

PAX基因家族具有高度保守的進(jìn)化，能夠編碼多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子[9-12]。Pax6歸屬于PAX基因家族，在胚胎形成期是重要的轉(zhuǎn)錄因子，高表達(dá)于胰腺癌、胃腸腫瘤等腫瘤中[13-16]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[17-20]，Pax6高表達(dá)于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤上。但是目前，臨床還沒(méi)有弄清楚其對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)特性及機(jī)制。本研究結(jié)果表明，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中Pax6基因mRNA表達(dá)顯著高于瘤旁組織。Pax6沉默組Pax6蛋白相對(duì)表達(dá)量、HXO-RB44細(xì)胞存活率均顯著低于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組，HXO-RB44細(xì)胞侵襲數(shù)均顯著少于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組，ki-67、PI3K、MMP-2、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著低于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組，和上述相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致。

綜上所述，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤增殖侵襲能力在抑制Pax6基因表達(dá)后會(huì)極大程度降低，其作用機(jī)制和PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)，值得臨床充分重視。