王芳磊，龔國清

(中國藥科大學(xué)藥理學(xué)研究室，江蘇 南京 211198)

韋伯潘力氏小體(Weibel-Palade bodies,WPBs) 是一種內(nèi)皮細(xì)胞特有的雪茄型分泌細(xì)胞器，主要存在于動(dòng)脈、毛細(xì)血管、靜脈和心內(nèi)膜中。WPBs儲(chǔ)存了血管性血友病因子(von Willebrand Factor,VWF)、P選擇素、組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator,tPA)、白介素-8、嗜伊紅素-3、血管生成素-2、內(nèi)皮素-1等多種內(nèi)容物[1]。這些內(nèi)容物通過胞吐作用分泌到內(nèi)皮細(xì)胞外，參與止血、炎癥和血管生成等多種生理病理過程。血栓是機(jī)體凝血-抗凝功能失衡時(shí)，血液中有形成分在血管內(nèi)黏附聚集形成的血塊，會(huì)造成血管部分或全部堵塞。血栓形成頻繁發(fā)生在如動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病患者和部分惡性腫瘤患者中，這一定程度上會(huì)加劇這些疾病的發(fā)生發(fā)展，嚴(yán)重威脅著人類的健康[2-3]。本文主要綜述了WPBs及其主要內(nèi)容物對(duì)血栓形成的影響。

1 WPBs及其對(duì)血栓形成的影響

內(nèi)皮細(xì)胞是血管系統(tǒng)和組織的主要邊界，負(fù)責(zé)調(diào)控代謝產(chǎn)物、其他小分子以及能夠穿透內(nèi)皮屏障的細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，涉及復(fù)雜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞間連接的動(dòng)態(tài)調(diào)控。內(nèi)皮細(xì)胞胞吐作用是抵抗血管損傷的首要保護(hù)線之一，WPBs作為內(nèi)皮特異性分泌顆粒，能夠響應(yīng)各種激動(dòng)劑，快速提供止血和炎癥介質(zhì)。WPBs特殊的可彎曲的雪茄形柔性結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了其在內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)有限空間內(nèi)的可操作性[1]，這有利于在內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激時(shí)做出快速反應(yīng)釋放其內(nèi)容物。WPBs內(nèi)容物的含量并不是一成不變的，對(duì)于不同的血管狀況需要內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生不同分泌反應(yīng)，為此WPBs會(huì)選擇性地包含或排除某些內(nèi)容物，并隨著局部微環(huán)境的需要?jiǎng)討B(tài)控制這些內(nèi)容物的量[4]。例如，模擬層流的條件可導(dǎo)致WPBs中血管生成素-2含量降低；而暴露于促炎細(xì)胞因子會(huì)造成白介素-8上調(diào)等[4]。

新生WPBs在高爾基體中由管狀VWF結(jié)合到網(wǎng)格蛋白包被的新生囊泡中形成，新生成的WPBs包含多個(gè)與高爾基體的連接，并通過這些連接將非管狀VWF簇從高爾基體運(yùn)輸至WPBs腔，這些非管狀VWF簇在WPBs中逐漸聚集成為更大的長(zhǎng)串聚集體以促進(jìn)WPBs生長(zhǎng)[1,5]。成熟的WPBs厚約0.1 μm，長(zhǎng)度可達(dá)3 μm。在生物發(fā)生和成熟期間，WPBs募集了一組Rab GTP酶(Rab27A、Rab3B/D和Rab15)和Rab效應(yīng)分子(MyRIP、Slp4-a和Munc13-4)，兩者相互作用介導(dǎo)WPBs與細(xì)胞骨架和質(zhì)膜的相互作用，是WPBs快速胞吐作用的基礎(chǔ)[6]。其中Rab27A與MyRIP相互作用阻止WPBs的過早分泌；Rab3D抑制胞吐作用，并控制WPBs的形成和形狀。除此之外，成熟WPBs與質(zhì)膜的最終融合還需要N-乙基馬來酰亞胺敏感因子(N-ethylmaleimide sensitive factor,NSF)和可溶性NSF附著蛋白受體(soluble NSF attachment protein receptor,SNARE)家族的蛋白介導(dǎo)。Munc13-4是Munc13蛋白家族的成員，存在于靜息內(nèi)皮細(xì)胞中的WPBs上，并且能在組胺刺激后在WPBs胞吐作用的位點(diǎn)處聚集。Munc13-4被認(rèn)為在SNARE介導(dǎo)的胞吐融合事件中起束縛和引發(fā)因子的作用，是誘發(fā)WPB胞吐作用的正調(diào)節(jié)因子[7]。有研究發(fā)現(xiàn)了一種膜聯(lián)蛋白A2(AnxA2)-S100A10蛋白復(fù)合物，它的S100A10亞基是Munc13-4的相互作用物[7]。

WPBs的快速分泌是對(duì)血管損傷或感染的快速反應(yīng)的基礎(chǔ)，最大限度地減少了失血和病原體的傳播[5,8]。由此我們可設(shè)想通過人為干預(yù)上述蛋白分子調(diào)節(jié)WPBs的快速分泌來尋找預(yù)防或治療血栓的新靶點(diǎn)。鑒于AnxA2-S100A10介導(dǎo)成熟WPB的胞吐作用以及因此釋放超長(zhǎng)VWF纖維中的重要作用，干擾AnxA2-S100A10復(fù)合物形成可以作為控制VWF分泌的高度特異性工具，具有激活/抑制內(nèi)皮細(xì)胞血栓形成的潛能。AnxA2中的S100A10結(jié)合位點(diǎn)限于N末端10至12個(gè)殘基，合成包含該序列的肽可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合S100A10以破壞復(fù)合物以抑制血栓形成[9]。但這些N-末端AnxA2肽不能穿透細(xì)胞膜，因此它們?cè)诨罴?xì)胞系統(tǒng)甚至生物體中的適用性受到很大限制，于是開發(fā)了一些具有膜滲透性的小分子化學(xué)抑制劑如3-羥基-1H-吡咯(5 H)-2-酮類似物和1,2,4-三唑類似物作為AnxA2與S100A10結(jié)合的抑制劑[9]。這些化合物彌補(bǔ)了N-末端AnxA2肽不能穿透細(xì)胞膜的缺點(diǎn)，并且可以特異性干擾AnxA2-S100A10復(fù)合物介導(dǎo)的血栓形成前反應(yīng)過程中內(nèi)皮細(xì)胞WPBs的對(duì)接/融合，具有優(yōu)良的抑制血栓形成的作用。

2 VWF及其對(duì)血栓形成的影響

VWF是一種多聚體黏附糖蛋白，其前體由信號(hào)肽和一段D1-D2-D′-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK的保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中D1D2結(jié)構(gòu)域代表前肽，D′至CK結(jié)構(gòu)域代表成熟的VWF[1]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中VWF前體去除信號(hào)肽，CK結(jié)構(gòu)域以“尾-尾”方式形成二聚體，隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體[10-11]。在高爾基體中前肽被弗林蛋白酶切割下來，以指導(dǎo)D′D3結(jié)構(gòu)域以“頭-頭”方式形成多聚體和進(jìn)一步聚縮成小管[1,10]。VWF的修飾主要包括弗林蛋白酶切割、糖基化、氧化和硫酸化，有研究表明FAM20c (family with sequence similarity 20,member C)磷酸化VWF A2結(jié)構(gòu)域中的S1517和S1613位點(diǎn)，這種修飾增強(qiáng)了VWF與血小板的相互作用[12-13]。目前FAM20c的抑制劑的研究大多關(guān)注于癌癥、骨骼缺陷和低磷血癥，尚未有關(guān)于抗血栓的FAM20c抑制劑研究，開發(fā)針對(duì)血栓的FAM20c的抑制劑是具有一定前景的新思路。VWF主要通過三種途徑分泌，分別為基礎(chǔ)分泌，調(diào)節(jié)型分泌和組成型分泌。WPBs中高度多聚化的VWF通過基礎(chǔ)分泌和調(diào)節(jié)型分泌兩種途徑，未進(jìn)入WPBs的不經(jīng)歷高度多聚化的VWF則通過組成型分泌途徑[14]?；A(chǔ)分泌持續(xù)發(fā)生，而調(diào)節(jié)型分泌是通過激動(dòng)劑介導(dǎo)的內(nèi)皮活化觸發(fā)的急性途徑，在分泌過程中，WPBs的pH值逐漸增加至血液的弱堿性，致使前導(dǎo)肽解離，小管展開將超長(zhǎng)VWF釋放到血流中參與止血和血栓形成。

VWF參與血管眾多生理與病理反應(yīng)，是止血和血栓形成的核心。內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)，WPBs快速反應(yīng)，分泌VWF至基底膜，基底膜上暴露的膠原通過與VWF A1結(jié)構(gòu)域相互作用而結(jié)合VWF，然后血小板膜上糖蛋白GPIb/IX再通過與VWF-膠原結(jié)合成復(fù)合物促使血小板初步黏附并被激活，隨后VWF與整合素結(jié)合使血小板穩(wěn)固黏附形成血栓[11,15]。同時(shí)P選擇素、血管生成素-2和骨保護(hù)素進(jìn)入WPBs也需要VWF的介導(dǎo)，其中P選擇素是通過與VWF的D′D3結(jié)構(gòu)域相互作用從而被包含入WPBs，而骨保護(hù)素和血管生成素-2則是通過與VWF的A1結(jié)構(gòu)域相互作用進(jìn)入WPBs。VWF對(duì)于血栓發(fā)生與發(fā)展的重要性是毋庸置疑的，開發(fā)靶向VWF的抗血栓藥物在未來具有廣闊的發(fā)展前景。

獲得性血栓性血小板減少性紫癜(acquired thrombotic thrombocytopenic purpura，aTTP)是一種由血小板在超大VWF聚集體上聚集引起的微血管血栓性疾病，病因是缺乏血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13),導(dǎo)致形成過多超大的VWF多聚體，病理性地觸發(fā)血小板聚集形成血栓。這種微血管血栓的形成會(huì)導(dǎo)致多器官缺血，并可能導(dǎo)致危及生命的并發(fā)癥[16]。Cablivi(Caplacizumab)是首個(gè)特異性的aTTP治療藥物，也是首個(gè)上市的納米抗體藥物。通過靶向VWF A1結(jié)構(gòu)域抑制其與血小板GPIb/IX結(jié)合，Caplacizumab減少了由VWF介導(dǎo)的血小板黏附和消耗，防止微血管血栓的形成[17]。在Caplacizumab之前，aTTP沒有特異性療法，僅能采用免疫抑制劑或血漿置換緩解，但仍具有10%～20%死亡率且易發(fā)生耐受，Caplacizumab很好地解決了這一問題。納米抗體具有分子量小的優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)也存在半衰期短的問題，為了解決這一問題，Caplacizumab通過一個(gè)3*丙氨酸的linker，連接2個(gè)抗VWF的納米抗體以此延長(zhǎng)半衰期。

3 P選擇素及其對(duì)血栓形成的影響

P選擇素是一種糖蛋白，在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，分別儲(chǔ)存于血小板的α顆粒和內(nèi)皮細(xì)胞的WPBs中。P選擇素具有一個(gè)大內(nèi)腔結(jié)構(gòu)域和短胞質(zhì)尾區(qū)，內(nèi)腔結(jié)構(gòu)域是P選擇素并入WPBs的定位結(jié)構(gòu)。在受到炎癥因素等刺激時(shí)，WPBs分泌P選擇素至細(xì)胞膜與中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上的P選擇素糖蛋白配體(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)相互作用進(jìn)而介導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面的滾動(dòng)與血小板的黏附，進(jìn)一步誘導(dǎo)血小板活化，擴(kuò)大血栓的發(fā)生[18]。例如組胺，有研究提出組胺會(huì)喚起質(zhì)膜上攜帶P選擇素的WPBs發(fā)生胞吐作用，釋放P選擇素之后Rab46依賴性地誘導(dǎo)WPBs逆運(yùn)輸至微管組織中心[19]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)在激光損傷誘導(dǎo)的血栓形成模型中，給予P選擇素阻斷抗體的VWF-/-小鼠血栓生長(zhǎng)速率顯著降低。這些研究均表明了P選擇素對(duì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞上血栓的增殖重要性[20]。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptor -γ，PPARγ)是由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、血壓和胰島素敏感性等作用，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)。E-V290M小鼠是一種選擇性表達(dá)顯性失活PPARγ突變體的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。與野生型小鼠相比，E-V290M小鼠更易產(chǎn)生由氯化鐵或光化學(xué)損傷誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈血栓，其 P選擇素表達(dá)和白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用均顯著上調(diào)。由此可推測(cè)PPARγ通過下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞P選擇素表達(dá)和減少P選擇素介導(dǎo)的白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用抑制血栓形成[21]。有數(shù)據(jù)表明，噻唑烷二酮類藥物作為PPARγ激動(dòng)劑，可以通過加速血管內(nèi)皮再生，抑制血小板活性和減少血栓前因子的表達(dá)來減少動(dòng)脈損傷后的血栓形成趨勢(shì)[22]。

炎癥與血栓的密切關(guān)系使得P選擇素這個(gè)在兩種生理病理過程中都有著重要作用的蛋白受到高度重視，已經(jīng)開發(fā)出抗P選擇素抗體用于血栓和(或)炎癥的治療，如重組可溶性P選擇素糖蛋白配體-1等。因此，抗P選擇素治療血栓將隨著P選擇素與血栓性疾病研究的深入和闡明，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值和前景。

4 其他內(nèi)容物及其對(duì)血栓形成的影響

tPA具有高效的纖維蛋白溶解活性，當(dāng)血栓形成時(shí)，tPA激活纖溶酶活性，確保再通的及時(shí)性[23]。內(nèi)皮素-1是人類心血管系統(tǒng)中最有效的血管收縮劑，具有非常持久的作用[24]，其血漿水平可能有助于預(yù)測(cè)一般人群中充血性心力衰竭和死亡風(fēng)險(xiǎn)[25]。WPBs分泌內(nèi)皮素-1導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能障礙促進(jìn)了血栓的形成，高內(nèi)皮素-1水平的患者在接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后發(fā)生支架內(nèi)血栓形成的概率大大升高[25]。血管生成素-2是血管形成和維持的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可將血管炎癥從活躍狀態(tài)轉(zhuǎn)化為靜止?fàn)顟B(tài)，從而恢復(fù)組織的穩(wěn)態(tài)[26]。研究發(fā)現(xiàn)血管生成素-2和P選擇素相互排斥，前者僅摻入缺乏P選擇素的WPBs中[1]。鑒于此種情況，我們不妨猜測(cè)通過干預(yù)包含血管生成素-2的WPBs的數(shù)量，以此減少含P選擇素的WPBs數(shù)量可抑制血栓形成，這也許能夠?yàn)閺V大研究者們提供抗血栓藥物研究的新思路。

5 展望

隨著對(duì)WPBs的生物發(fā)生及其快速分泌機(jī)制研究的深入，WPBs快速分泌VWF和P選擇素等內(nèi)容物對(duì)血栓形成的影響越來越清晰。目前研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞受激活化時(shí)，WPBs快速反應(yīng)釋放VWF和P選擇素等因子，這些因子通過與膠原、血小板糖蛋白GPIb/IX、中性粒細(xì)胞和白細(xì)胞等相互作用參與或促進(jìn)血栓形成。在WPBs眾多內(nèi)容物中，對(duì)血栓影響最大的是VWF和P選擇素，兩者都直接參與血栓的形成，內(nèi)皮細(xì)胞P選擇素在一定程度上受VWF調(diào)控。以WPBs以及VWF等因子為靶點(diǎn)的抗血栓抗體或化合物如卡普塞珠單抗和3-羥基-1H-吡咯(5 H)-2-酮類似物等都具有良好的抗血栓效果。鑒于WPBs、VWF和P選擇素在血栓疾病中扮演著重要角色，深入研究WPBs快速分泌的調(diào)控機(jī)制，VWF和P選擇素參與血栓形成的作用機(jī)理，有望為血栓相關(guān)疾病的防治提供更多有效的新靶點(diǎn)，也將在今后的抗血栓藥物研發(fā)策略中帶來新的思考方式。