劉圓圓，徐魯源,賀美蓮

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，北京 100034；2.國藥控股山東有限公司，山東 濟(jì)南 250001；3.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101)

格列吡嗪是常用的第二代磺酰脲類降糖藥，主要用于飲食控制效果不良的輕、中度2型糖尿病患者。其作用機(jī)制是刺激胰島的β細(xì)胞分泌胰島素，從而降低血糖水平。格列吡嗪與第一代磺酰脲類降糖藥相比，與劑量相關(guān)的副作用如頭痛，惡心，疲勞等有所減少[1-2]。格列吡嗪作為2型糖尿病治療的一線藥物，其控釋制劑的作用時(shí)間延長，具有良好的降低空腹與餐后血糖的效果[3-4]?，F(xiàn)有的測定生物基質(zhì)中格列吡嗪濃度的方法有高效液相色譜-紫外檢測(HPLC-UV)[5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[6-8]。其中LC-MS/MS法具有靈敏度高、快速、前處理簡便的優(yōu)勢，成為生物等效性研究的常用方法。故本研究在此基礎(chǔ)上，建立了測定人血漿中格列吡嗪濃度的LC-MS/MS方法，并采用單劑量、兩周期、兩序列、交叉的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對24名健康受試者分別進(jìn)行空腹及高脂餐后的生物等效性預(yù)試驗(yàn)，考察其藥代動(dòng)力學(xué)過程，以期為正式的生物等效性試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(AB SCIEX Triple Quad 5500)；格列吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品(99.7%，批號：100281-201604，中檢院)；格列吡嗪-d11(化學(xué)純度：98%，同位素內(nèi)標(biāo)純度：97.6%，批號：7-SDJ-115-1，TRC)。甲醇、乙腈、甲酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(色譜純)；超純水。受試制劑：格列吡嗪控釋片(5 mg/片)，參比制劑：格列吡嗪控釋片(5 mg/片，Pfizer Pharmaceuticals LLC)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex Kinetex C18色譜柱 (2.1 mm×50 mm,2.6 μm)，柱溫45 ℃，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B為純乙腈，流速0.6 mL·min-1，梯度洗脫程序見表1。

2.2 質(zhì)譜條件 電離方式：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；離子源溫度：550 ℃ ；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；離子化電壓：5 500 V ；入口電壓(EP):10 V；碰撞室出口電壓(CXP)：29 V。監(jiān)測離子對：格列吡嗪：446.1/321.1，噴撞能量(CE)：19 V，去簇電壓(DP)：136 V ；格列吡嗪-d11：457.1/321.1，CE：21 V，DP：136 V。

表1 梯度洗脫程序

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取格列吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品適量，用DMF溶解成質(zhì)量濃度為 1.0 mg·mL-1的對照品儲備液。準(zhǔn)確移取適量對照品儲備液，用50%乙腈水溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為40、80、400、1 000、2 000、3 000、5 000、6 000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液和質(zhì)量濃度分別為40、120、800、4 000 ng·mL-1的質(zhì)控樣品工作溶液。準(zhǔn)確稱取格列吡嗪-d11標(biāo)準(zhǔn)品適量，用DMF溶解成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲備液，用乙腈將內(nèi)標(biāo)儲備液稀釋至20 ng·mL-1，作為內(nèi)標(biāo)工作溶液。

2.4 樣品預(yù)處理 精密移取100 μL血漿樣品，加入400 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液(20 ng·mL-1格列吡嗪-d11)沉淀蛋白，然后渦旋混勻5 min，在4 ℃的臺式高速冷凍離心機(jī)中，4 750 rpm離心10 min ，取上清液100 μL，并加入10%乙腈水100 μL稀釋，渦旋混勻5 min，進(jìn)樣測定。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與殘留 準(zhǔn)確移取空白血漿285 μL， 加入 15 μL格列吡嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，使樣品中格列吡嗪的質(zhì)量濃度分別為2、4、20、50、100、150、250、300 ng·mL-1。按“2.4”項(xiàng)下所述進(jìn)行樣品處理，采用LC-MS/MS 方法測定，記錄色譜圖。以分析物的濃度為橫坐標(biāo)(X)，以分析物與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.010 25X-0.001 72(r2=0.999 0，n=8)，結(jié)果顯示格列吡嗪血藥濃度在2～300 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為2 ng·mL-1。

圖1中a為格列吡嗪在定量下限處的選擇離子色譜圖，保留時(shí)間為 0.36 min，峰形與分離度良好。在同樣的保留時(shí)間處，空白血漿樣品色譜圖(見圖1b)中沒有干擾峰出現(xiàn)，顯示該方法的殘留很小，不會對分析物及內(nèi)標(biāo)的定量造成干擾。

2.5.2 準(zhǔn)確度與精密度 質(zhì)控樣品的制備、處理及測定與標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品相同，質(zhì)量濃度分別為2、6、40、200 ng·mL-1，表示為LLOQ、LQC、MQC和HQC。共測定3個(gè)分析批，每一濃度取6份樣品分析。結(jié)果顯示批內(nèi)準(zhǔn)確度為 95.0%～106.5%，批間準(zhǔn)確度為99.5%～102.2%，批內(nèi)精密度均小于7.0%，批間精密度均小于5.0% (見表 2)。試驗(yàn)結(jié)果顯示該方法精密度，準(zhǔn)確度良好。

表2 準(zhǔn)確度與精密度

2.5.3 選擇性、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率 選擇性需要考察6批不同來源的空白血漿，分別配制成空白樣品以及定量下限濃度的樣品進(jìn)行比較。結(jié)果顯示6批空白血漿中干擾組分的響應(yīng)均為0，血漿的內(nèi)源性組分未造成干擾。由這6批空白血漿預(yù)處理后得到上清液加入適當(dāng)濃度的工作溶液配制成基質(zhì)效應(yīng)樣品，與相同濃度的純?nèi)芤簶悠愤M(jìn)行比較，由二者的峰面積比值來計(jì)算，分析物的基質(zhì)因子為98.5%，內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子為96.5%。提取回收率考察LQC，MQC和HQC 3 個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，然后再取空白血漿預(yù)處理后加入適當(dāng)濃度工作溶液配得同濃度的樣品，二者峰面積的比值即為提取回收率。結(jié)果表明，分析物的回收率為107.4%，內(nèi)標(biāo)的回收率為113.4%。

2.5.4 穩(wěn)定性 首先考察了對照品和內(nèi)標(biāo)的儲備液和工作溶液在室溫放置12 h的穩(wěn)定性。然后，配制LQC和HQC樣品各 3 份，分別考察其在自動(dòng)進(jìn)樣器中的穩(wěn)定性、血漿樣品5次凍融循環(huán)的穩(wěn)定性以及室溫放置27 h的穩(wěn)定性。根據(jù)新鮮制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析上述條件下的樣品，將測得濃度與理論濃度相比較，結(jié)果顯示準(zhǔn)確度偏差均在15%范圍內(nèi)，說明格列吡嗪在上述條件下均能保持良好的穩(wěn)定性。

2.6 生物等效性研究 招募24名健康成年受試者，身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)在19～26 kg·m-2。受試者在試驗(yàn)前均通過既往史、體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查(包括血生化、血常規(guī)、尿常規(guī)、傳染性疾病篩查、心電圖、胸片及試驗(yàn)相關(guān)各項(xiàng)檢查)。所有受試者均為自愿參加本次試驗(yàn)，理解研究程序與風(fēng)險(xiǎn)且已簽署知情同意書。

本研究采用單中心、開放、隨機(jī)、單劑量、兩周期、兩序列、交叉的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察空腹和餐后兩種條件下(各12名受試者)的生物等效性。采用SAS9.4軟件將受試者隨機(jī)分為兩組，每組6人?？崭乖囼?yàn)中，保證受試者給藥前禁食不禁水至少10 h。第1周期6例受試者在給藥當(dāng)天早晨空腹?fàn)顟B(tài)下口服受試制劑格列吡嗪控釋片5 mg，另6例受試者則口服參比制劑格列吡嗪控釋片5 mg，7 d的清洗期后交叉給藥進(jìn)行第2周期研究。餐后試驗(yàn)中，保證受試者給藥前禁食不禁水至少10 h，于次日晨進(jìn)食高脂餐，30 min內(nèi)進(jìn)食完畢，然后口服受試制劑或參比制劑。試驗(yàn)分別于給藥前0 h和給藥后1、2、3、4、6、8、9、10、12、14、16、24、28、32、36、48 h共17個(gè)采血點(diǎn)分別抽取靜脈血4 mL，用于血藥濃度測定。

使用WinNonlin 6.4軟件以非房室模型處理血藥濃度數(shù)據(jù)并估算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，包括：Cmax、AUC0～t、AUC0～∞、Tmax、t1/2等。主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(Cmax，AUC)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后以多因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，然后用雙向單側(cè)t檢驗(yàn)和計(jì)算90%置信區(qū)間的統(tǒng)計(jì)分析方法來評價(jià)和判斷受試制劑和參比制劑之間的生物等效性?？崭购筒秃髼l件下兩制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3，平均藥時(shí)曲線見圖2。

表3 受試制劑與參比制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較(n=12)

空腹給藥試驗(yàn)結(jié)果顯示，受試制劑Cmax、AUC0-t、AUC0～∞的90%置信區(qū)間分別為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的91.82%～111.81%、83.98%～122.10%、85.73%～124.83%，均在80.00%～125.00%以內(nèi)，說明格列吡嗪控釋片受試制劑與參比制劑在空腹給藥時(shí)具有生物等效性。餐后給藥試驗(yàn)結(jié)果顯示，受試制劑Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信區(qū)間分別為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的82.03%～106.76%、81.43%～117.32%、83.35%～119.07%，均在80.00%～125.00%以內(nèi)，說明格列吡嗪控釋片受試制劑與參比制劑在餐后給藥時(shí)也具有生物等效性。綜上所述，格列吡嗪這兩種片劑在空腹和餐后條件下均具有生物等效性。

3 結(jié)論

本文建立了快速、靈敏的LC-MS/MS方法用于測定人血漿中的格列吡嗪濃度，并將其應(yīng)用于人體生物等效性預(yù)試驗(yàn)。在試驗(yàn)過程中，受試者均未有臨床意義的藥物不良反應(yīng)出現(xiàn)。在空腹和餐后給藥條件下，受試制劑與參比制劑在吸收程度和代謝速度上無顯著性差異，生物學(xué)等效。同時(shí)，由表3和圖2可見，餐后給藥與空腹給藥相比，Cmax更大，而Tmax更小，說明高脂餐后給藥對格列吡嗪的吸收、分布有一定影響。該結(jié)果可為格列吡嗪的臨床合理用藥提供參考依據(jù)。另外，依據(jù)此次生物等效性預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該試驗(yàn)方案的采樣時(shí)間、采樣量、時(shí)間間隔等設(shè)計(jì)較為合理，具有較強(qiáng)的適用性。本試驗(yàn)為格列吡嗪控釋劑的生物等效性研究提供了數(shù)據(jù)參考，為正式試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。