馮旭平，康紅梅，趙銘森，高金虎，孟曉康，薛紅麗

（山西農(nóng)業(yè)大學（山西省農(nóng)業(yè)科學院）經(jīng)濟作物研究所，山西汾陽032200）

大麻（Cannabis L.）是一種古老的經(jīng)濟作物，為大麻科大麻屬1年生草本植物，按用途可分為纖維用大麻、籽用大麻和藥用大麻[1]。大麻纖維具有抑菌、抗紫外線輻射、抗靜電等特性，可被應用于紡織、造紙和汽車內(nèi)飾[2]。大麻籽中油脂和蛋白質含量較高，可用來制作蛋白粉、大麻油等。其花葉含有的大麻二酚（CBD），是一種無精神活性的酚類物質，在醫(yī)學上具有減輕驚厥、炎癥、焦慮和嘔吐的作用，也可緩解腫瘤化療帶來的不適反應，抑制癌細胞生長。目前，市面上已有的防治艾滋病、精神疾病等方面的藥物如屈大麻酚、大麻隆和Sativex等，它們中都含有CBD成分。另外，大麻植株中含有的酚類物質及其衍生物，也可阻礙細菌等微生物代謝作用和生理活動，因而，可被用于抗紫外線、抗氧化的護膚產(chǎn)品[3-5]。

大麻多樣化的用途促進了大麻產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。但大麻植株中含有一種叫四氫大麻酚（Tetrahydrocannabinol，THC）的酚類物質，它是一種精神活性物質，屬于“毒品”管制的范疇，人體吸入后會出現(xiàn)幻覺、妄想、雙重人格等[6]。因此，大麻的栽培、種植、應用受到嚴格的管制。國際上把THC含量小于0.3%的大麻稱為工業(yè)大麻，具有加工利用價值的工業(yè)大麻，必須在一定管制條件下可規(guī)模種植生產(chǎn)。目前，我國只有云南、黑龍江兩省制定了工業(yè)大麻種植、加工的地方法規(guī)，在這2個省的政府監(jiān)管下可進行種植。其他省份只允許纖維、籽用工業(yè)大麻的種植。

我國現(xiàn)存的大麻種質資源比較匱乏，如地方品種河南的固始麻、安徽的皖大麻等基本上是作為纖維麻來種植，不可或不適宜作籽用、藥用；同時由于地理因素的限制，不適宜在其他地方種植。因此，培育THC含量低（小于0.3%）的高油、高蛋白、高CBD專用型工業(yè)大麻新品種，豐富工業(yè)大麻遺傳種質資源迫在眉睫。一般來說，通過物種的自然變異獲得新品種的速度慢、時間久、頻率小。隨著科學技術的發(fā)展，可以通過人工手段加快物種的變異，如利用射線進行輻射的物理誘變、利用化學藥劑進行化學誘變、送入太空進行太空輻射等，各種方法各有優(yōu)劣。其中，運用化學誘變劑甲基磺酸乙酯（Ethyle methanesulfonate，EMS）來進行誘變是一種較為簡便、經(jīng)濟、易操作的誘變方法。EMS可以通過與DNA核苷酸中的堿基對作用使其結構改變，誘發(fā)點突變[7-8]。此誘變方法對植物基因組的改變較小，類似于自然界的自發(fā)突變，對作物產(chǎn)生的不利影響較小，故經(jīng)常被人們用來進行誘變育種。目前，EMS誘變育種已在西瓜、辣椒、黃瓜、水稻、小麥、玉米、馬鈴薯、油菜、煙草等農(nóng)作物中廣泛被應用[9-10]。EMS誘變具有兩面性，需要選擇合適的誘變條件來達到需要的誘變目的。

本試驗以優(yōu)良工業(yè)大麻品種汾麻3號種子為材料，通過設置不同的EMS體積分數(shù)和作用時間，調(diào)查統(tǒng)計其發(fā)芽率和芽長，來確定汾麻3號種子適宜的誘變條件，以期為下一步的工業(yè)大麻種質資源創(chuàng)制、新品種的選育、突變體庫的構建等提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試大麻品種為山西省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所大麻課題組選育的籽用工業(yè)大麻新品種汾麻3號。該品種植株高大，分枝多，籽粒中等大小，油脂含量較高[11]，適合在山西大部分丘陵山坡地種植。

1.2 試劑

EMS原液購自上海恒遠生物科技有限公司。其他試劑購自太原飛達科貿(mào)公司，試劑標準為分析純。

1.3 試驗方法

試驗于2018年冬季在山西省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所（汾陽）所內(nèi)實驗室進行。汾麻3號種子在室溫下被浸種16 h，再挑選出飽滿、成熟度好、未露白的種子進行誘變處理。試驗設6個EMS體積分數(shù)梯度，即0（CK）、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%、4.0%，2個誘變浸種時間（7.5、17.0 h），3次重復，共36個處理。每個處理50粒種子，放于15 mL的一次性離心管中進行誘變處理。誘變處理時將36個處理的離心管置于緩慢振蕩的搖床上，使種子與誘變劑充分接觸。

各處理誘變結束后往離心管中加入適量1 mol/L硫代硫酸鈉溶液來終止誘變反應，過程需10～20 min。取出誘變后的種子放置在流動的自來水下沖洗2 h，從而徹底洗去藥物殘留。室溫下稍微晾干后，再將其裝入培養(yǎng)皿置于人工智能氣候箱中進行紙上發(fā)芽培養(yǎng)。培養(yǎng)皿中濾紙需每天加水保持濕潤。人工智能氣候箱具體設置為：光級I級（約1 500 lx），光周期為12 h/12 h（光/暗），溫度為25℃/20℃（光/暗），相對濕度RH為70%。

每天觀察記錄各處理種子的發(fā)芽情況，并根據(jù)發(fā)芽率計算相對發(fā)芽率。其中，各種子發(fā)芽以芽長度大于0.2 cm為標準，具體芽長用1 cm×1 cm方格紙進行測量?；谂囵B(yǎng)到后期容易產(chǎn)生細菌污染以及芽壞死情況，把培養(yǎng)81 h后的發(fā)芽狀況作為本試驗的最終發(fā)芽結果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 22.0軟件進行分析；采用兩因素隨機區(qū)組進行方差統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同誘變體積分數(shù)和誘變時間處理下汾麻3號種子的萌發(fā)動態(tài)分析

通過觀察發(fā)現(xiàn)，處理終止后就已經(jīng)有少量種子露白萌動。在人工智能氣候箱培養(yǎng)56 h后就已經(jīng)有大部分種子發(fā)芽，此時CK種子的平均發(fā)芽率已達91.45%，EMS體積分數(shù)為2.5%的處理種子發(fā)芽率也達到45%，芽長達2.92 cm；培養(yǎng)81 h后CK與0.5%EMS體積分數(shù)處理的種子發(fā)芽率都在90%以上，芽長分別為7.41、8.66 cm。從圖1可以看出，在相同的體積分數(shù)與處理時間下，隨著培養(yǎng)時間的增加，種子發(fā)芽率增高，芽長變化規(guī)律則不一致，EMS體積分數(shù)為2.5%和4.0%的處理，培養(yǎng)81 h時種子芽長高于培養(yǎng)56 h的；而EMS體積分數(shù)為1.0%和1.5%處理，培養(yǎng)56 h的芽長則高于81 h的。這可能是由于EMS滲透進入種子內(nèi)，參與或抑制其不同的發(fā)芽過程。另外也可能是每個種子對EMS的拮抗作用不同，因此，這種抑制不具有線性關系。

2.2 不同誘變體積分數(shù)和誘變時間處理下汾麻3號種子的發(fā)芽情況分析

由表1可知，EMS體積分數(shù)為0.5%時，種子的發(fā)芽率與對照相差不大，處理時間7.5 h時發(fā)芽率為99.00%（相應的CK為93.00%），處理時間17.0 h時，發(fā)芽率為96.02%（相應的CK為98.00%）。隨著EMS體積分數(shù)的增加，發(fā)芽率逐漸降低；在EMS低體積分數(shù)（0.5%、1.0%、1.5%）時，發(fā)芽率分別為99.00%、93.00%、91.00%（處理7.5 h）和96.02%、89.96%、84.00%（處理17.0 h），降幅比較?。辉诟唧w積分數(shù)（2.5%、4.0%）時，發(fā)芽率分別是72.36%、61.00%（處理7.5 h）和41.00%、3.00%（處理17.0 h），后者降幅較大。方差分析結果表明（表2），不同體積分數(shù)、處理時間，以及二者互作之間差異極顯著，P值分別為0.000、0.000、0.001。其中，不同EMS體積分數(shù)處理的種子發(fā)芽率從大到小排序為0.5%＞0（CK）＞1.0%＞1.5%＞2.5%＞4.0%。其中，0（CK）、0.5%、1.0%、1.5%之間差異不顯著，它們與2.5%、4.0%之間差異顯著，2.5%與4.0%之間差異也顯著。

表1 不同EMS體積分數(shù)和處理時間對汾麻3號種子萌發(fā)的影響

表2 不同EMS體積分數(shù)和處理時間下種子發(fā)芽率的方差分析

芽長的變化規(guī)律也類似。由表1可知，隨著EMS體積分數(shù)的增加，芽長逐漸變小，EMS體積分數(shù)為0.5%時，2種處理時間下種子的平均芽長在8.66 cm，在EMS體積分數(shù)為1.0%時，芽長為6.13 cm，EMS體積分數(shù)為1.5%時，芽長為5.11 cm，在高體積分數(shù)2.5%和4.0%時，芽長分別縮短到3.84、2.09 cm。說明EMS體積分數(shù)越高越抑制種子胚芽的生長。在不同處理時間下，EMS體積分數(shù)為0.5%時，芽長分別是9.28 cm（7.5 h）和8.05 cm（17.0 h），二者相差1.23 cm；在EMS體積分數(shù)為2.5%時，芽長分別是5.31 cm（7.5 h）和2.37 cm（17.0 h），二者相差2.94 cm。由此可見，處理時間增加芽長減小，且低體積分數(shù)時減小幅度小，高體積分數(shù)時減小幅度大。方差分析結果表明（表3），EMS體積分數(shù)之間差異極顯著（P＝0.000），處理時間以及二者互作之間差異不顯著（P＞0.05）。其中，不同EMS體積分數(shù)處理的種子芽長從長到短排序為0.5%＞0（CK）＞1.0%＞1.5%＞2.5%＞4.0%。其中，低體積分數(shù)0、0.5%、1.0%、1.5%之間差異不顯著，但它們與2.5%、4.0%之間差異顯著，另外，高體積分數(shù)2.5%與4.0%之間差異也顯著。

總的來說，在同一處理時間下，隨著EMS體積分數(shù)的增加，發(fā)芽率降低；在同一體積分數(shù)下，隨著處理時間的增加，發(fā)芽率降低。芽長變化規(guī)律也類似，隨著EMS體積分數(shù)的增加，芽長縮短，處理時間長的種子芽長降幅更大。

表3 不同EMS體積分數(shù)和處理時間下種子芽長的方差分析

2.3 EMS誘變適宜體積分數(shù)和時間條件分析

本試驗中，汾麻3號種子在較低體積分數(shù)（0～1.5%）時，發(fā)芽率相對較高（91%～99%）；在高體積分數(shù)（2.5%～4.0%）時，發(fā)芽率則降低。從圖2可以看出，隨著EMS體積分數(shù)的增加，種子數(shù)量越來越少，芽長也減小。隨著處理時間從7.5 h增加到17.0 h，種子數(shù)量也明顯減少，即發(fā)芽率減小，芽長變短。考慮到大麻種子適宜的播種深度為2～3 cm，芽太短不利于出苗，建議EMS體積分數(shù)為2.5%、處理時間為7.5 h可以作為相對適宜的誘變條件。

3 結論與討論

EMS應用于許多作物的誘變育種中。陳煜等[12]研究發(fā)現(xiàn)，陸地棉魯6269的出苗率為49%的誘變條件是1.0%的EMS處理10 h。陳喜明等[13]研究發(fā)現(xiàn)，0.8%的EMS處理8 h是蕓豆種子的最佳誘變條件。安佰義等[14]利用EMS誘變白樺種子，發(fā)現(xiàn)EMS顯著抑制種子的發(fā)芽率以及發(fā)芽起始時間。姜穎[15]研究發(fā)現(xiàn)，EMS誘變大麻品種火麻1號種子的適宜濃度為1.5%，處理時間為8 h，格里昂為1.5%濃度和6 h的處理時間；金刀15為1.5%濃度和8 h的處理時間。其研究還發(fā)現(xiàn)，EMS對胚根、胚軸的生長有抑制作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，高體積分數(shù)的EMS顯著降低汾麻3號種子的發(fā)芽率、相對發(fā)芽率以及芽長，并且抑制種子的萌發(fā)與芽的生長。但是，本研究得出的汾麻3號種子最適誘變條件為：EMS體積分數(shù)2.5%、處理時間7.5 h。與前人研究結果比，EMS體積分數(shù)相對較高，處理時間較少。這在其他作物上也有類似的研究結果。如楊楠等[16]研究發(fā)現(xiàn)，6%的EMS溶液處理12、24 h可作為誘導知母種子建立突變體庫的適宜條件。其研究結果中，EMS濃度高達6%。這可能與品種、種子類型以及誘變所用的緩沖液、誘變處理時的溫度和種子前處理等有關，也可能與EMS溶液濃度與處理時間的互作效應有關。關于EMS體積分數(shù)與誘變時間的互作效應，前人也有發(fā)現(xiàn)。程蛟文等[17]研究發(fā)現(xiàn)，EMS溶液濃度、誘變時間以及二者交互作用均對苦瓜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率具有顯著影響，其半致死條件為：先清水浸種8 h，用1.5%或1.2%處理2 h。姚恒等[18]通過用不同體積分數(shù)與不同處理時間誘變烤煙K326種子，得出EMS體積分數(shù)1.15%處理12 h或者0.88%處理16 h，或者0.7%體積分數(shù)處理12 h或者1.1%體積分數(shù)處理8 h都是該品種的半致死條件。

明確EMS誘變適宜條件是開展EMS誘變育種研究的前提。EMS在大麻上的誘變只有少數(shù)人進行過研究?？紤]到品種與地域的特異性，有必要重新研究篩選確定特定品種的適宜誘變條件，為相關人員開展下一步的誘變育種提供參考。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，較低體積分數(shù)（0.5%）的EMS可刺激大麻種子的萌發(fā)，使其發(fā)芽率、芽長高于對照。另外在本試驗中也發(fā)現(xiàn)，同一濃度下誘變時間長的發(fā)芽率以及芽長高于或大于誘變時間短的情況，可能是由于試驗中運用硫代硫酸鈉終止反應以及清水清洗藥劑不夠徹底，導致藥物有少量殘留所致或者與誘變處理時種子與溶液未充分接觸有關或者是EMS誘變劑對該種子的誘變作用并不是表現(xiàn)在抑制芽長方面。

隨著市場經(jīng)濟的發(fā)展，工業(yè)大麻作為一種特殊的經(jīng)濟作物，其基礎研究和多功能利用越來越受到重視。種質資源是開展各類研究應用的首要前提，國外的高CBD品種，CBD含量能達到20%且THC又符合國際標準（≤0.3%）。目前，國內(nèi)的資源大都是纖維用或籽用，可提取利用大麻酚類物質CBD、CBG、THC等方面的種質資源相對欠缺，如作為在云南大規(guī)模種植的藥用品種云麻8號，CBD含量也未超過2%，而其他省份更未有這方面資源。利用各種手段如EMS誘變等構建其突變體庫并結合基因測序等手段，可以快速確定變異基因明確其功能，從而更快速高效地選育出市場需求的各種特性的專用型品種。

本試驗結果表明，工業(yè)大麻汾麻3號適宜的EMS誘變條件是：2.5%EMS體積分數(shù)和7.5 h處理時間。