張彐寧，高維娟，周曉紅，靳曉飛

(河北中醫(yī)學(xué)院河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091)

腦缺血/再灌注(cerebral ischemia-reperfusion，CIR)損傷由缺血腦組織恢復(fù)血流供應(yīng)所引起，是缺血性腦卒中治療過程中產(chǎn)生的病理性損傷[1]，凋亡在其病理進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。毛蕊異黃酮是中藥黃芪的有效活性成分，是一種潛在的神經(jīng)保護(hù)劑[2]，本研究旨在探討毛蕊異黃酮對(duì)腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠60只，♂，體質(zhì)量280±20 g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。

1.2 主要試劑毛蕊異黃酮(上海士峰生物制品有限公司)；MCAO栓線(北京西濃科技有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma)；甲苯胺藍(lán)染液、BCA 蛋白測(cè)定試劑盒(Solarbio)；尼莫地平、Bax和Bcl-2抗體(Servicebio)；caspase-3抗體(CST)；TUNEL染色試劑盒(Promega)。

1.3 主要儀器組織包埋機(jī)、切片機(jī)(Leica)；倒置熒光顯微鏡(Carl Zeiss)；多功能成像系統(tǒng)(Vilber)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與模型制備參照文獻(xiàn)[3]的方法造模，根據(jù)Zea Longa 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，1～3分者為造模成功，列為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。大鼠隨機(jī)分為：假手術(shù)組、模型組、毛蕊異黃酮低、中、高劑量組(5、10、20 mg· kg-1，Calycosin)，采用TTC、HE和尼氏染色，觀察毛蕊異黃酮對(duì)腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，篩選出毛蕊異黃酮最佳治療劑量，之后將大鼠隨機(jī)分為：假手術(shù)組、模型組、毛蕊異黃酮組(Calycosin，20 mg· kg-1)、尼莫地平組(Nimodipine，0.7 mg· kg-1，陽(yáng)性對(duì)照藥組)，采用TUNEL染色和Western blot檢測(cè)各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。各給藥組于再灌注的同時(shí)腹腔注射相應(yīng)劑量藥物，給藥體積8 mL· kg-1，假手術(shù)組和模型組等體積腹腔注射生理鹽水。

1.5 TTC染色檢測(cè)各組大鼠腦梗死體積造模給藥結(jié)束后，斷頭取腦，做冠狀位切片，用2% TTC染液恒溫避光孵育30 min，拍照后，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析圖片并計(jì)算腦梗死體積。

1.6 HE染色觀察各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)改變各組切片脫蠟至水，蘇木精浸染5～8 min，流水沖洗，鹽酸酒精分色，伊紅浸染1～3 min，自來水浸洗，最后脫水透明封片，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 尼氏染色檢測(cè)各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞尼氏體平均光密度值各組切片脫蠟至水，用1%甲苯胺藍(lán)恒溫避光孵育30 min，最后脫水透明封片，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況按照試劑盒說明書，將各組切片利用蛋白酶K處理20 min，利用TUNEL反應(yīng)混合液于37 ℃室溫避光孵育1 h。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察成像。

1.9 Western blot檢測(cè)各組大鼠Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)各組蛋白樣品經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜封閉后，分別用Bax、Bcl-2、caspase-3、β-actin一抗與膜上的抗原結(jié)合，4 ℃過夜，TBST洗去一抗，然后加入相應(yīng)二抗與其反應(yīng)，多功能成像系統(tǒng)下掃描成像。

2 結(jié)果

2.1 TTC染色檢測(cè)腦梗死體積的結(jié)果與Sham組相比，Model組大鼠TTC染色白色缺血區(qū)明顯，有明顯的梗死灶形成(P<0.05)；與Model組相比，毛蕊異黃酮低、中、高劑量組腦梗死體積均有所減小(P<0.05)，其中以高劑量組最為明顯。見Tab 1。

Tab 1 Effects of calycosin on cerebral infarction volume and Nissl body in

2.2 HE染色觀察神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)的結(jié)果與Sham組相比，Model組細(xì)胞皺縮，核固縮、深染，神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較差；與Model組相比，毛蕊異黃酮低、中、高劑量組神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，其中以高劑量組最為明顯。

2.3 尼氏染色檢測(cè)各組大鼠尼氏體平均光密度值的結(jié)果與Sham組相比，Model組細(xì)胞皺縮，輪廓模糊不清，尼氏體明顯減少，并且平均光密度值明顯降低(P<0.05)。與Model組相比，毛蕊異黃酮低、中、高劑量組尼氏體明顯增多，平均光密度值明顯增加(P<0.05)，其中以高劑量組最為明顯。見Tab 1。

2.4 TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的結(jié)果與Sham組相比，Model組凋亡神經(jīng)細(xì)胞明顯增多(P<0.05)。與Model組相比，Calycosin組和Nimodipine組凋亡神經(jīng)細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。見Tab 2。

Tab 2 Effects of calycosin on apoptosis and apoptotic proteins

2.5 Western blot檢測(cè)各組大鼠Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)的結(jié)果與Sham組相比，Model組促凋亡蛋白Bax、caspase-3的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與Model組相比，Calycosin組和Nimodipine組促凋亡蛋白Bax、caspase-3的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見Tab 2。

3 討論

細(xì)胞凋亡在腦缺血/再灌注病理進(jìn)程中扮演了重要角色，腦缺血/再灌注引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡方式主要以細(xì)胞凋亡為主[4-5]，有效抑制細(xì)胞凋亡對(duì)于減輕腦缺血/再灌注損傷具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)， 腦缺血/再灌注損傷后，腦梗死體積明顯增大，神經(jīng)細(xì)胞明顯收縮，胞核深染固縮，尼氏體明顯減少，凋亡神經(jīng)細(xì)胞明顯增多，促凋亡蛋白Bax 、caspase-3表達(dá)明顯增多，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯減少。當(dāng)給予毛蕊異黃酮處理后，腦缺血/再灌注大鼠腦梗死體積明顯減少，細(xì)胞狀態(tài)明顯改善，尼氏體明顯增多，凋亡神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，促凋亡蛋白Bax、caspase-3表達(dá)明顯降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯升高。本研究初步表明毛蕊異黃酮可減小腦梗死體積，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕腦缺血/再灌注損傷，其分子機(jī)制與毛蕊異黃酮調(diào)控凋亡關(guān)鍵蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3表達(dá)密切相關(guān)。