李世英，汪 艷,2,3

(南方醫(yī)科大學(xué) 1.藥學(xué)院、2. 中心實(shí)驗(yàn)室，3.南方醫(yī)院感染內(nèi)科暨肝病中心，廣東 廣州 510515)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD) 的主要特征為肝細(xì)胞脂肪變性[1-3]。細(xì)胞中的脂肪積累和處置之間的失調(diào)是導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性的主要原因[4]。線粒體丙酮酸載體(mitochondrial pyruvate carrier，MPC)于2012年被發(fā)現(xiàn)，其主要功能是將細(xì)胞質(zhì)中的丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體中。丙酮酸是一種重要的代謝中間體，參與糖異生、脂質(zhì)新生、膽固醇合成以及維持三羧酸循環(huán)[5-6]。因此，MPC在糖、脂質(zhì)代謝中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，MPC是治療NAFLD的潛在靶點(diǎn)[7]。抑制MPC可以促進(jìn)NAFLD患者肝臟的脂質(zhì)代謝，顯著改善患者的脂肪變性情況[8]，但是關(guān)于MPC抑制劑調(diào)控脂肪變的分子機(jī)制仍不明確。

以往文獻(xiàn)報(bào)道，正常小鼠敲除MPC1基因，腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)信號(hào)通路、脂肪酸β氧化途徑被激活。可見(jiàn), 肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A)表達(dá)上調(diào)。而脂質(zhì)生成的相關(guān)基因乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)則顯著下調(diào)[9-10]。這些文獻(xiàn)報(bào)道提示，MPC與AMPK-ACC通路可能存在調(diào)控作用，然而至今尚未有研究證明，這種調(diào)控作用是否與肝細(xì)胞脂肪變性有關(guān)。

棕櫚酸(palmitic acid，PA)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立體外高脂負(fù)荷模型常被用作模擬體外NAFLD模型[11]。因此我們選擇這一體外模型研究MPC活性的抑制對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響及其分子機(jī)制，旨在探索抑制MPC對(duì)PA所致HepG2細(xì)胞脂肪變性以及AMPK-ACC通路進(jìn)的影響，為改善NAFLD肝細(xì)胞脂肪變性提供線索。

1 材料

1.1 細(xì)胞來(lái)源HepG2 細(xì)胞(批號(hào):xbz-030)，購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.2 試劑PBS溶液(批號(hào):C10010500BT)、0.25% 胰酶(批號(hào):25200056)、DMEM高糖培養(yǎng)基(批號(hào):C11995500BT)、胎牛血清(批號(hào):10099-141)購(gòu)自Gibco公司；PA(批號(hào):P0500-10)購(gòu)自Sigma 公司；MPC抑制劑UK5099(批號(hào):56396-35-1)購(gòu)自MCE 公司；CCK8檢測(cè)試劑盒(批號(hào):C0037)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型) (批號(hào):P0010S)購(gòu)自碧云天公司；總 RNA 提取試劑盒 RNAiso Plus(批號(hào):T9109)、RT-PCR 反應(yīng)擴(kuò)增試劑盒(批號(hào):RR047A)購(gòu)自TakaRa 公司；油紅O染色試劑盒(批號(hào):BB-44612-2)購(gòu)自廣州一科生物科技有限公司；p-AMPK(批號(hào)；2535T)抗體購(gòu)自CST公司；AMPK抗體(批號(hào):ab32047)、p-ACC抗體(批號(hào):ab68191)、ACC抗體(批號(hào):ab45174)、SREBP1抗體(批號(hào):ab193318)購(gòu)自Abcam公司。

1.3 儀器酶標(biāo)儀(美國(guó) BIO-TEK公司)；電子分析天平(BS210S型，北京賽多利斯天平有限公司)；高速臺(tái)式離心機(jī)(MIKRO200，Hettich公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7500型，ABI公司)；PCR擴(kuò)增儀(ETC811，蘇州東盛興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)；NanoDrop2000核酸超微量測(cè)定儀(GNM15140，Genom)；全自動(dòng)蛋白質(zhì)定量檢測(cè)儀(Wes，美國(guó)Protein Simple)；倒置相差顯微鏡(倒置 TS100，NIKON)；明場(chǎng)正置顯微成像系統(tǒng)(德國(guó)Leica)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和主要試劑配制細(xì)胞在含有10% FBS的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。等細(xì)胞長(zhǎng)到接近90%，用0.25% 胰酶對(duì)其消化、傳代。PA配制為5 mol·L-1的母液，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩PC抑制劑UK5099配置為0.05 mol·L-1的母液，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫俑鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要稀釋為各濃度。

2.2 CCK8測(cè)定細(xì)胞活力為了確認(rèn)不同濃度PA以及MPC抑制劑 UK5099是否會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生顯著影響，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)之前利用CCK8對(duì)HepG2細(xì)胞的活力進(jìn)行檢測(cè)。將HepG2細(xì)胞鋪在96孔板中，d 2將培養(yǎng)液改換為以下培養(yǎng)基:正常對(duì)照組:高糖完全培養(yǎng)基；PA組:0、0.1、0. 5、1.0 mmol·L-1PA的完全培養(yǎng)基；MPC抑制組:0、10、20、50 μmol·L-1UK5099的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h或者48 h。然后棄去孔板中的培養(yǎng)液，改換為含 10% CCK8 的基本培養(yǎng)基處理細(xì)胞 60 min，記錄酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處所測(cè)得的吸光度。細(xì)胞相對(duì)存活力為各實(shí)驗(yàn)組的所測(cè)得的吸光度與正常組所測(cè)的的吸光度之比。

2.3 細(xì)胞的分組將HepG2細(xì)胞使用胰酶消化后，重新種植于6孔板上。次日改為無(wú)血清的培養(yǎng)基饑餓24 h。細(xì)胞分組:換上含完全培養(yǎng)基為正常對(duì)照組，含0.5 mmol·L-1的PA的完全培養(yǎng)基作為體外高脂負(fù)荷模型組，添加了10 μmol·L-1UK5099、0.5 mmol·L-1的PA的完全培養(yǎng)基作為抑制劑組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞的總RNA或蛋白用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 Real-time PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)4 ℃條件下使用TRIzol技術(shù)提取總RNA，按照說(shuō)明書操作方法制備cDNA。然后在ABI Prism 7500 PCR儀利用SYBR Green-BSAed Real-time PCR進(jìn)行分析。檢測(cè)以下目的基因:AMPK、ACC、SREBP1、CPT1A，以GAPDH為內(nèi)參基因。以上目標(biāo)基因的表達(dá)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)基因重復(fù)測(cè)定3次。引物序列見(jiàn)Tab 1。

2.5 全自動(dòng)蛋白質(zhì)定量檢測(cè)儀定量檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)于4 ℃條件下使用含PMSF抑制劑的RIPA試液提取總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒檢測(cè)其濃度，并調(diào)整樣品最終上樣濃度為1 g·L-1。于全自動(dòng)蛋白質(zhì)檢測(cè)儀定量測(cè)定AMPK、p-AMPK、ACC、p-ACC、SREBP1蛋白的表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參蛋白。運(yùn)用全自動(dòng)蛋白質(zhì)定量檢測(cè)儀配套軟件Compass for SW軟件對(duì)靶蛋白的條帶密度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6 油紅O染色觀察脂質(zhì)堆積用一次性吸管去除各孔原培養(yǎng)液，用適量PBS清洗后加入濃度為4% 的中性甲醛，暗處處置15 min；用蒸餾水洗去固定液；然后加入油紅O工作液，密封處理后，在37 ℃避光靜置30 min；棄去工作液，蒸餾水沖洗；利用顯微鏡進(jìn)行觀察，鏡下顯示脂滴陽(yáng)性結(jié)果為胞質(zhì)呈橘紅色。油紅O染色定量方法:棄去6孔板中的PBS，將6孔板置于干燥通風(fēng)處，使每孔中的水分揮干。用異丙醇對(duì)溶解在脂滴中的油紅O進(jìn)行萃取，即每孔加入200 μL異丙醇，密封，置于37 ℃搖床20 min，將提取液轉(zhuǎn)移至96孔板中，200 μL異丙醇作為調(diào)零孔，于酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)各組的OD值。

Tab 1 Sequence primer of selected genes

3 結(jié)果

3.1 不同濃度PA、MPC抑制劑UK5099對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響用CCK-8法檢測(cè)不同濃度PA、UK5099對(duì)HepG2細(xì)胞活力影響，結(jié)果如Fig 1A所示，0、0.1、0.5 mmol·L-1PA處理24、48 h對(duì)細(xì)胞活力均無(wú)影響；1、2 mmol·L-1PA抑制了HepG2細(xì)胞活性。如Fig 1B所示，10 μmol·L-1UK5099處理48 h對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響，20、50 μmol·L-1UK5099處理24 h抑制HepG2細(xì)胞活力。本實(shí)驗(yàn)為了排除UK5099對(duì)PA所致肝細(xì)胞脂肪變和AMPK-ACC通路的影響是由于抑制HepG2細(xì)胞活力引起的，我們最終選擇對(duì)HepG2細(xì)胞活性影響不大的濃度，即0.5 mmol·L-1PA以及10 μmol·L-1UK5099處理48 h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度以及時(shí)間點(diǎn)。

3.2 抑制MPC可以改善PA所致HepG2細(xì)胞脂質(zhì)堆積的情況結(jié)果如Fig 2顯示， 0.5 mmol·L-1PA處理48 h， HepG2細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)油滴數(shù)量大小及含脂滴細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.01)，呈環(huán)狀聚集于胞質(zhì)內(nèi)；0.5 mmol·L-1PA添加10 μmol·L-1UK5099 處理48 h，胞質(zhì)內(nèi)脂滴數(shù)量、大小及含脂滴細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.01)?？梢?jiàn)，MPC抑制劑UK5099可以改善PA所致HepG2細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)堆積情況。

3.3 體外抑制MPC通過(guò)激活A(yù)MPK-ACC通路改善脂質(zhì)堆積情況RT-PCR結(jié)果如Fig 3顯示，0.5 mmol·L-1PA處理HepG2細(xì)胞48 h，可以提高ACC、SREBP1 mRNA的表達(dá)水平(P<0.01)，并降低AMPK(P<0.01)、CPT1A (P<0.05)mRNA的表達(dá)水平；與0.5 mmol·L-1PA組相比，0.5 mmol·L-1PA添加10 μmol·L-1UK5099 處理48 h，可以降低ACC、SREBP1 mRNA的表達(dá)水平(P<0.01)， 并提高AMPK、CPT1A mRNA的表達(dá)水平(P<0.01)。

全自動(dòng)蛋白分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 4所示，0.5 mmol·L-1PA處理HepG2細(xì)胞48 h，可以降低細(xì)胞的p-AMPK 、p-ACC蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，并且提高AMPK(P<0.05)、ACC(P<0.01)、SREBP1(P<0.01)蛋白表達(dá)水平；與0.5 mmol·L-1PA組相比，0.5 mmol·L-1PA添加10 μmol·L-1UK5099 處理48 h，細(xì)胞的p-AMPK、p-ACC蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)，ACC、SREBP1蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.01)，AMPK蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化。

4 討論

肝細(xì)胞脂肪變性是NAFLD的主要特征，因此探索肝細(xì)胞脂肪變性的分子機(jī)制對(duì)該疾病的診治尤為重要。在本實(shí)驗(yàn)，為了排除高濃度的PA或MPC抑制劑UK5099對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用，干擾UK5099改善PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性，是由于UK5099對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用，還是UK5099通過(guò)激活A(yù)MPK-ACC通路所導(dǎo)致的，因此我們首先利用CCK-8實(shí)驗(yàn)，選出對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用較小的低濃度PA(0.5 mmol·L-1)、低濃度UK5099(10 μmol·L-1)進(jìn)行后續(xù)分子機(jī)制相關(guān)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度UK5099可以明顯改善PA所致HepG2細(xì)胞脂肪變性。

Fig 1 Cell viability of HepG2 cells treated with different concentrations of (A) PA or (B) UK5099 n=6)

Fig 2 Intracellular lipid accumulation in HepG2 cells treated with PA and UK5099 (scale bar 50 μm) n=6)

Fig 3 Effect of UK5099 treatment on relative mRNA levels of AMPK-ACC pathways in HepG2 cells treated with n=6)

Fig 4 Effect of UK5099 treatment on protein levels of AMPK, p-AMPK, ACC, p-ACC, SREBP1 in HepG2 cells treated with n=3)

AMPK-ACC通路在體內(nèi)脂質(zhì)代謝中具有關(guān)鍵調(diào)控作用[12]。ACC可以控制丙二酰輔酶A的生成，進(jìn)而參與脂質(zhì)新生，并且能下調(diào)CPTIA，抑制脂肪酸氧化[13]。AMPK在調(diào)控ACC活性中具有關(guān)鍵作用[14-16]，AMPK通過(guò)磷酸化激活后，進(jìn)一步磷酸化ACC，使后者失去活性，進(jìn)而抑制脂質(zhì)新生，并上調(diào)CPT1A的活性，從而促進(jìn)肝細(xì)胞脂質(zhì)分解[17]。我們選用PA誘導(dǎo) HepG2細(xì)胞建立體外高脂負(fù)荷模型，添加MPC抑制劑UK5099加以干預(yù)，探究MPC在肝細(xì)胞脂肪變性中的作用。本研究通過(guò)油紅O染色實(shí)驗(yàn)、RT-PCR以及全自動(dòng)蛋白質(zhì)量分析實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol·L-1PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞48 h后，胞質(zhì)內(nèi)油脂堆積水平明顯提高，p-AMPK、p-ACC蛋白表達(dá)水平明顯降低，SREBP1蛋白表達(dá)水平則明顯升高。進(jìn)一步的抑制MPC，則可逆轉(zhuǎn)櫚酸所致HepG2細(xì)胞脂質(zhì)堆積情況，同時(shí)能夠提高p-AMPK、p-ACC蛋白表達(dá)水平，降低脂質(zhì)合成關(guān)鍵因子SREBP1蛋白表達(dá)水平，并提高脂肪酸β氧化關(guān)鍵基因CPT1A mRNA的表達(dá)水平。說(shuō)明MPC抑制劑可以激活A(yù)MPK-ACC通路，改善肝細(xì)胞脂肪變性情況。

綜上可知，體外抑制MPC可以通過(guò)激活A(yù)MPK-ACC通路，改善細(xì)胞脂質(zhì)堆積情況。本實(shí)驗(yàn)初步闡明了MPC與脂質(zhì)代謝機(jī)制，為后續(xù)治療NAFLD肝細(xì)胞脂肪變性提供科學(xué)依據(jù)。由于時(shí)間限制，抑制MPC活性對(duì)脂質(zhì)堆積的影響的功能研究中，僅從降低其活性單方面驗(yàn)證了這一現(xiàn)象，尚未進(jìn)行增強(qiáng)表達(dá) MPC對(duì)脂質(zhì)代謝的影響。今后的研究中將利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)基因小鼠等進(jìn)一步完善這部分內(nèi)容，此外，MPC是否可以調(diào)控其他脂質(zhì)代謝相關(guān)通路有待進(jìn)一步探索。