李冬冬 田雪芬 王 靜 周 瑋 張丹丹

山東省濟(jì)寧市中醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272037

二黃益腎湯是我院腎病科老中醫(yī)以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方，是由丹參、黃芪、大黃、炒白術(shù)、炙淫羊藿、莪術(shù)、砂仁、石葦?shù)?0味中藥采用傳統(tǒng)工藝結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)制成的口服液體劑型，具有補(bǔ)腎健脾、活血通絡(luò)、清熱泄?jié)嶂πВ山档蛢?nèi)生肌酐和尿素氮水平，臨床上主要用于氣虛濕瘀型慢性腎功能不全的治療。該方療效顯著，不良反應(yīng)小，使用安全，深受廣大患者的好評(píng)。方中大黃為君藥，性苦、寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃素能明顯減輕單側(cè)輸尿管結(jié)扎腎間質(zhì)纖維化模型大鼠腎組織病理學(xué)損傷程度，且大鼠腎組織PDGF-B表達(dá)明顯減少，說(shuō)明大黃素能夠減緩腎組織纖維化進(jìn)程，具有腎臟保護(hù)作用[1]；大黃酸可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HBZY-1大鼠腎小球系膜細(xì)胞的增殖，可以降低血清肌酐、血尿素氮和24 h尿蛋白水平[2]。

二黃益腎湯現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)只有【性狀】及【檢查】項(xiàng)，無(wú)【鑒別】與【含量測(cè)定】項(xiàng)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)不完善。為有效控制本制劑的質(zhì)量，完善質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，保障臨床用藥的安全、有效，故對(duì)丹參和黃芪采用TLC進(jìn)行定性鑒別，對(duì)大黃中的大黃酸、大黃素和大黃酚采用RP-HPLC進(jìn)行定量測(cè)定，本研究從TLC和RP-HPLC兩方面入手，建立該產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津)；AB135-S型十萬(wàn)級(jí)電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；ZF-8暗箱三用紫外分析儀(上海一科儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 丹參對(duì)照藥材(批號(hào)120923-201615)；黃芪對(duì)照藥材(批號(hào)120974-201612)；大黃酸(純度≥99%，批號(hào)110757-201607)；大黃素(純度≥98%，批號(hào)110756-201512)；大黃酚(純度≥99%，批號(hào)110796-201621)；黃芪甲苷(純度≥97%，批號(hào)110781-201717)均來(lái)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

二黃益腎湯(規(guī)格：每瓶150 mL，濟(jì)寧市中醫(yī)院制劑室制，批號(hào)：20181014、20181129、20181227)。

甲醇(色譜純，Avantor Performance Materials, Inc., USA; GC≥99.9%)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別[3]

2.1.1 丹參[4]取本品(批號(hào)20181014)20 mL，加10%稀鹽酸調(diào)pH至2.0，再用乙酸乙酯振搖提取2次，每次50 mL，合并兩次提取液，揮干乙酸乙酯，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得供試品溶液。取除丹參以外的其余藥材，按二黃益腎湯的處方和工藝制成溶液，再按供試品的制備方法處理，即得陰性對(duì)照溶液。再取丹參對(duì)照藥材0.6 g，加水100 mL，加熱回流1.5 h，濾過(guò)，濾液濃縮至約20 mL，放冷，按供試品的制備方法處理，即得對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，依次吸取對(duì)照藥材溶液5 μL、供試品溶液8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(10∶2∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴3%三氯化鐵乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。如圖1所示。

2.1.2 黃芪[5-7]取本品(批號(hào)20181014)25 mL，用水飽和的正丁醇振搖提取3次(首次輕輕振搖)，每次40 mL，合并提取液，用氨液洗滌 2 次(50 mL、30 mL)，棄去氨液，再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次30 mL，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得供試品溶液。取除黃芪外的其余藥材，按二黃益腎湯的處方和工藝制成不含黃芪的溶液，再按供試品的制備方法處理，即得陰性對(duì)照溶液。取黃芪對(duì)照藥材2.0 g，加水50 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液濃縮至約20 mL，同法即得對(duì)照藥材溶液。再取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成l mg·mL-1的溶液，即得對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液各4 μL、供試品溶液8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置超過(guò)6 h的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，相應(yīng)位置處陰性對(duì)照無(wú)斑點(diǎn)。如圖2所示。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品混合儲(chǔ)備液的制備 分別精密稱(chēng)取大黃素對(duì)照品、大黃酸對(duì)照品和大黃酚對(duì)照品各2.13、6.66和2.22 mg，分別置于5 mL、1 mL和2 mL量瓶中，用甲醇至刻度，搖勻，各吸取1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得0.0426 mg·mL-1大黃素對(duì)照品、0.666 mg·mL-1大黃酸對(duì)照品和0.111 mg·mL-1大黃酚對(duì)照品混合儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液的制備[3,8-10]精密量取樣品(批號(hào)20181129)50 mL，置燒瓶中，加8%鹽酸100 mL，超聲處理3 min，再加三氯甲烷150 mL，水浴回流40 min，放冷，三氯甲烷層置分液漏斗中，再用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷液，上層酸液再用150 mL三氯甲烷水浴回流一次(20 min)，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次100 mL，合并提取液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件[11-13]Purospher star RP-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以甲醇-0.1%磷酸溶液(70∶30)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為255 nm；柱溫為25 ℃；流速1.0 mL·min-1。

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品混合儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成41.625、83.25、166.5、333.0、499.5、666.0 μg·mL-1的大黃酸對(duì)照品和2.663、5.325、10.65、21.3、31.95、42.6 μg·mL-1的大黃素對(duì)照品以及6.94、13.88、27.75、55.5、83.25、111.0 μg·mL-1的大黃酚對(duì)照品混合溶液，不同濃度的對(duì)照品混合溶液各進(jìn)樣8 μL，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄對(duì)應(yīng)峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得大黃酸的回歸方程為Y=6472.816X-5364.543，r=1.000 0，線(xiàn)性范圍為41.625～666.0 μg·mL-1；大黃素的回歸方程為Y=27439.750X-26299.681，r=0.999 9，線(xiàn)性范圍為2.663～42.6 μg·mL-1；大黃酚的回歸方程為Y=13646.903X-23053.364，r=0.999 9，線(xiàn)性范圍為6.94～111.0 μg·mL-1。

2.2.5. 方法學(xué)驗(yàn)證[14-15]

2.2.5.1 精密度試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品混合儲(chǔ)備液6 μL，注入色譜儀中，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算大黃酸、大黃素和大黃酚RSD分別為1.36%、1.08%和1.44%。結(jié)果表明，儀器精密度較好。

2.2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液5 μL，注入色譜儀中，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件操作，分別于0、4、8、12、16、24 h間隔下進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算大黃酸、大黃素和大黃酚RSD分別為2.26%、2.98%和2.89%。由結(jié)果可知，供試品中的3種化合物在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(批號(hào)20181129)，按2.2.2項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件操作，均進(jìn)樣1次，記錄峰面積，計(jì)算大黃酸、大黃素和大黃酚RSD分別為2.29%、2.06%和2.18%。由結(jié)果可知，方法重復(fù)性良好。

2.2.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 平行取6份已知含量的同一批號(hào)樣品(批號(hào)20181129)各50 mL，分別加入含量相當(dāng)量80%、100%、120%的大黃酸、大黃素和大黃酚混合對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)下的方法制備成溶液，每次進(jìn)樣5 μL，結(jié)果見(jiàn)表1。大黃酸平均回收率為97.45%，RSD為0.39%；大黃素平均回收率為98.63%，RSD為1.18%；大黃酚平均回收率為98.15%，RSD為0.89%。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

續(xù)表1 表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.2.6 專(zhuān)屬性 按處方和工藝制成不含大黃的陰性對(duì)照樣品，再按2.2.2項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。標(biāo)準(zhǔn)品混合儲(chǔ)備液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。混合標(biāo)準(zhǔn)品、供試品和陰性對(duì)照的HPLC圖如圖3所示。

2.2.7 定量限、檢測(cè)限 取對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)⌒旁氡萐/N為10的作為定量限，大黃酸、大黃素和大黃酚的定量限分別為4.386、5.532、9.470 ng；取信噪比S/N為3的作為檢測(cè)限，分別為2.525、4.056、6.061 ng。

2.2.8 樣品含量測(cè)定 取3批樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備兩份，分別測(cè)定，計(jì)算二黃益腎湯樣品中大黃酸、大黃素和大黃酚含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 二黃益腎湯中大黃酸、大黃素和大黃酚含量測(cè)定結(jié)果 (mg·mL-1，n=3)

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別 二黃益腎湯主要是由大黃、丹參、黃芪、炙淫羊藿、炒白術(shù)、莪術(shù)等10味中藥組成，其中大黃為君藥，丹參、黃芪等為臣藥，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)無(wú)薄層鑒別項(xiàng)，因此定性鑒別選擇方中的臣藥加以研究。

黃芪的薄層鑒別中，樣品用水飽和的正丁醇提取后再用氨水洗滌，薄層展開(kāi)時(shí)發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)較多，斑點(diǎn)相互有干擾，因此樣品處理時(shí)最后添加了正丁醇飽和的水洗滌這一步驟，可以除去樣品中極性較小的雜質(zhì)；用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置的下層溶液為展開(kāi)劑進(jìn)行鑒別時(shí)，發(fā)現(xiàn)10 ℃以下放置超過(guò)6 h的展開(kāi)劑能有效降低斑點(diǎn)的拖尾，可以得到較好的展開(kāi)效果。

3.2 含量測(cè)定 大黃作為方中的君藥，具有降低尿素氮、保護(hù)殘存腎功能、延緩腎纖維化等作用，其有效成分主要以蒽醌類(lèi)為主，分為結(jié)合蒽醌和游離蒽醌，游離蒽醌的成分有大黃素、大黃酸和大黃酚等，這些都是大黃發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)[16]。大黃在提取過(guò)程中，游離蒽醌的損失量遠(yuǎn)高于結(jié)合蒽醌，導(dǎo)致游離蒽醌在溶液中的含量很低；另外，游離蒽醌在口服后，易在上消化道部位吸收[17]，最終到達(dá)大腸的量極有限，因此本試驗(yàn)對(duì)總蒽醌進(jìn)行定量測(cè)定。

樣品處理時(shí)，參考2015版《中華人民共和國(guó)藥典》大黃含量測(cè)定中總蒽醌的處理方法，先用8%鹽酸進(jìn)行酸水解，再用三氯甲烷萃取。但封淑華等[18]報(bào)道酸水解時(shí)酸的濃度對(duì)大黃酸有較大影響，對(duì)其他物質(zhì)影響極小，因此本試驗(yàn)中酸的濃度直接采用2015版《中華人民共和國(guó)藥典》大黃供試品溶液的制備方法。

參考文獻(xiàn)[11-12,19]，流動(dòng)相先后嘗試了甲醇∶0.1%磷酸水溶液70∶30、76∶24、80∶20、85∶15等多種洗脫程序，其中76∶24時(shí)大黃酸主峰與其前面的雜質(zhì)峰連在一起，隨著甲醇比例的提高，大黃酸主峰與雜質(zhì)峰近乎無(wú)法分離開(kāi)。之后將甲醇的比例在70%左右調(diào)節(jié)，綜合比較其分離度、拖尾因子、峰面積和經(jīng)濟(jì)性等指標(biāo)，最終選定甲醇∶0.1%磷酸水溶液70∶30作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相系統(tǒng)。

本試驗(yàn)使用二極管陣列檢測(cè)器(PDA)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(190～800 nm)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃樣品在255 nm處3個(gè)成分具有較大的吸收，且雜質(zhì)成分干擾少，故以255 nm作為大黃的檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本研究建立的質(zhì)量控制方法，經(jīng)過(guò)對(duì)多批產(chǎn)品的驗(yàn)證，結(jié)果表明薄層色譜法中斑點(diǎn)分離效果好，陰性溶液對(duì)樣品的定性鑒別無(wú)干擾，方法的專(zhuān)屬性較強(qiáng)。含量測(cè)定試驗(yàn)，具有良好的重復(fù)性，加樣回收率高，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。增加的薄層色譜鑒別和含量測(cè)定項(xiàng)，能有效控制二黃益腎湯的質(zhì)量，對(duì)二黃益腎湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定有一定提高作用。