吳春鳳 楊文娜 鄭景輝 劉春強(qiáng) 黃業(yè)保 張 嵐*

1.柳州市人民醫(yī)院，廣西 柳州 545006；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

便秘(Constipation)是臨床上常見的功能性胃腸道疾病，主要表現(xiàn)為大便干結(jié)、排出困難及排便頻率減少[1]。隨著生活節(jié)奏的日益加快與工作壓力的增加，便秘的患病率逐年上升。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，全世界成人慢性便秘發(fā)病率在2.5%～79%之間[2]，而我國慢性便秘的發(fā)病率約為6%[3]。目前便秘的西醫(yī)治療主要以各類瀉劑為主，療效欠佳。長期便秘可引起肛腸疾病，加速老年癡呆，嚴(yán)重時(shí)誘發(fā)心腦血管意外等疾病，甚至導(dǎo)致猝死[4]。中醫(yī)認(rèn)為便秘是大腸傳導(dǎo)功能失司的主要表現(xiàn)之一，根據(jù)其不同發(fā)病的病因病機(jī)進(jìn)行多層次、多角度的辨證施治，取得確切的臨床療效，并且在基礎(chǔ)的中藥藥理實(shí)驗(yàn)研究中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。

六磨湯出自元代名醫(yī)危亦林所著的《世醫(yī)得效方》卷六，由檳榔、沉香、木香、烏藥、大黃、枳殼各等分組成，具有調(diào)肝理脾、通便導(dǎo)滯的作用，尤其適用于氣機(jī)郁滯、大腸傳導(dǎo)失職之便秘?，F(xiàn)代藥理研究表明[5]，六磨湯可以促進(jìn)消化液分泌，增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)和腸肌張力，使胃腸收縮節(jié)律增強(qiáng)，對抗腸肌痙攣，對胃腸平滑肌有興奮和抑制雙向調(diào)節(jié)作用，抑制腸內(nèi)水分吸收，調(diào)節(jié)腸道功能，增加糞便的體積，使糞便軟化，使腸道運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間正常，從而促進(jìn)排便，較好地解決了排便困難的問題。

中醫(yī)藥具有“多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)”干預(yù)疾病的特點(diǎn)，傳統(tǒng)的藥理學(xué)研究不能系統(tǒng)的闡述中醫(yī)藥治療疾病的具體作用機(jī)制，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于生物信息學(xué)、分子生物學(xué)及各大數(shù)據(jù)庫信息系統(tǒng)地研究“藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”之間的相互作用，將當(dāng)前的“一靶一藥”模式的研究模式更新為新的“網(wǎng)絡(luò)靶多組分”模式，其觀念與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治的原則一致[6]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接方法，從“藥物-化合物-作用靶點(diǎn)-疾病”復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)探究六磨湯治療便秘的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)、分子生物學(xué)過程、信號(hào)通路等,以期為六磨湯的基礎(chǔ)研究提供參考思路。

1 材料與方法

1.1 六磨湯有效化合物及其作用靶標(biāo)的篩選 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)(Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology Platform，TCMSP)是融合了藥物化學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)預(yù)測等網(wǎng)絡(luò)信息的中藥系統(tǒng)、藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)，該數(shù)據(jù)庫收錄了近500個(gè)已經(jīng)在中國藥典注冊過了的草藥，囊括了超過31000種化學(xué)成分，其中藥化學(xué)庫較準(zhǔn)確全面[7]。研究利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，根據(jù)藥物分子的ADME性質(zhì)以口服生物利用度OB≥30%、類藥性DL≥0.18為篩選條件，篩選出六磨湯的六味藥檳榔、沉香、木香、烏藥、大黃和枳殼的有效化合物和對應(yīng)的化合物靶標(biāo)。將化合物靶標(biāo)蛋白逐一輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)檢索以剔除重復(fù)、非人源靶點(diǎn)，并轉(zhuǎn)化為活性化合物規(guī)范的靶點(diǎn)蛋白的基因標(biāo)識(shí)符(Gene Symbol)。

1.2 便秘相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)的預(yù)測 GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫提供所有有關(guān)注釋和預(yù)測人類基因的信息，它自動(dòng)整合來自約150個(gè)網(wǎng)絡(luò)來源的以基因?yàn)橹行牡臄?shù)據(jù)，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、遺傳、臨床和功能信息。CTD(http://ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫是個(gè)提供有關(guān)化學(xué)-基因/蛋白質(zhì)相互作用、化學(xué)-疾病和基因-疾病關(guān)系的人工整理信息的公開數(shù)據(jù)庫，可以從該數(shù)據(jù)庫里查看有關(guān)化學(xué)物質(zhì)的各種信息，包括化學(xué)結(jié)構(gòu)、相互作用基因和蛋白質(zhì)、推斷的疾病關(guān)系等。以“constipation”為檢索詞在GeneGards和CTD數(shù)據(jù)庫中搜查與便秘相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)，根據(jù)數(shù)據(jù)庫的默認(rèn)排序，各取前300個(gè)靶點(diǎn)，去掉重復(fù)的靶點(diǎn)，收集整合得到便秘相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)。

1.3 六磨湯對便秘的潛在治療靶點(diǎn)的收集及靶點(diǎn)的拓?fù)浞治?將1.1得到的化合物靶點(diǎn)和1.2收集到的疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0(http://bioinfo gp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線分析工具，得到交集靶點(diǎn)。STRING 10.5(https://string-db. org)數(shù)據(jù)庫是一個(gè)儲(chǔ)存已知的和預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫，其包含蛋白間直接的和間接的相互作用。觀察這些作用靶點(diǎn)蛋白之間的交互作用關(guān)系，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，將Organism設(shè)定為“Homo aspiens”，最小交互分?jǐn)?shù)取0.4，得到蛋白互作信息。由于STRING數(shù)據(jù)庫無法直觀的表現(xiàn)靶蛋白的Degree變化，故將STRING的蛋白互作信息保存為TSV格式并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件軟件中進(jìn)行可視化分析，在軟件中設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小與顏色反映Degree大小變化，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深Degree越大，邊的粗細(xì)反映Combined score大小變化，Combined score值越大邊越粗，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。并利用Network Analyzer功能進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，取度值和介?shù)均超過平均值的靶標(biāo)，認(rèn)為這些靶標(biāo)是關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO分析和KEGG分析 DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)是一個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫，整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，幫助用戶從中提取生物學(xué)信息。將1.3篩選出來的度值和介數(shù)均大于平均值的靶點(diǎn)即關(guān)鍵靶點(diǎn)，輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析和KEGG分析。

1.5 活性成分與靶蛋白的分子對接 分子對接能有效地確定與靶受體活性部位空間和電性特征相匹配的小分子化合物，進(jìn)而確定化合物進(jìn)入體內(nèi)后能否與靶點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮作用[8]。IGEMDOCK是款開源性的分子對接軟件，一般用于活性篩選和快速對接，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫查找靶蛋白對應(yīng)的活性成分，下載保存為mol 2格式，從Uniport數(shù)據(jù)庫中找到潛在靶點(diǎn)的蛋白信息，保存為pdb格式，將靶蛋白數(shù)據(jù)信息和其對應(yīng)的活性成分信息導(dǎo)入IGEMDICK軟件進(jìn)行分子對接。SystemsDock(http://systemsdock.unit.oist.jp)是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測和分析的Web服務(wù)器，它應(yīng)用高精度對接模擬和分子路徑圖來全面描述配體選擇性，并說明配體如何作用于復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)，故同時(shí)利用在線分子對接服務(wù)器SystemsDock進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 六磨湯有效化合物的收集 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜集到木香有106個(gè)化合物、枳殼17個(gè)化合物、大黃92個(gè)化合物、檳榔52個(gè)化合物、烏藥128個(gè)化合物，根據(jù)“OB≥30%、DL≥0.18”篩選后，檳榔有8個(gè)有效化合物，木香6個(gè)，枳殼5個(gè)，大黃16個(gè)，烏藥9個(gè)。TCMSP數(shù)據(jù)庫未收錄沉香的化合物，研究利用Batman-tcm數(shù)據(jù)庫搜索沉香的化合物，得到50個(gè)化合物，由于batman-tcm提供的化合物沒有OB、DL等參考值，故將這50個(gè)化合物重新輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選，最后有2個(gè)化合物符合篩選標(biāo)準(zhǔn)。這六味藥共有46個(gè)有效化合物，其中木香和烏藥共同有sitosterol這個(gè)化合物，枳殼、大黃和烏藥共同擁有beta-sitosterol這個(gè)化合物，故去掉重復(fù)化合物后剩43個(gè)有效化合物，對應(yīng)116個(gè)化合物靶點(diǎn)。詳見表1。

表1 六磨湯有效化合物

續(xù)表1 表1 六磨湯有效化合物

2.2 便秘的相關(guān)疾病靶點(diǎn)與六磨湯治療便秘的靶點(diǎn)的收集 以“constipation”為檢索詞在GeneGards和CTD數(shù)據(jù)庫中搜查與便秘相關(guān)的靶點(diǎn)，GeneGards提供了2815個(gè)靶點(diǎn)，CTD數(shù)據(jù)庫提供了19296個(gè)靶點(diǎn)，根據(jù)數(shù)據(jù)庫的默認(rèn)評分值，去重后各取前300個(gè)有代表性的靶點(diǎn)，和六磨湯篩選出來的靶點(diǎn)一同導(dǎo)入Venny 2.1在線分析工具得到交集靶點(diǎn)54個(gè)，認(rèn)為這54個(gè)靶點(diǎn)是六磨湯治療便秘的潛在作用靶點(diǎn)。如圖1所示。

2.3 六磨湯治療便秘的潛在作用靶點(diǎn)的PPI及靶點(diǎn)的拓?fù)浞治?蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)是指兩個(gè)或兩個(gè)以上蛋白質(zhì)分子通過非共價(jià)鍵形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的過程，蛋白質(zhì)之間相互作用構(gòu)成了細(xì)胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)重要組成部分。觀察六磨湯治療便秘的54個(gè)潛在治療靶點(diǎn)這些靶蛋白間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，將54個(gè)靶蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，再經(jīng)過Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析，結(jié)果如圖2所示。蛋白交互作用值取中度0.4的時(shí)候，CHRM3和KCNH2與其他蛋白沒有相互作用關(guān)系，該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中共有52個(gè)節(jié)點(diǎn)，拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)平均節(jié)點(diǎn)度為22.7，介數(shù)中心性約為0.012，平均最短路徑在1.1～2.1之間，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的連通度曲線、介數(shù)中心性曲線接近于冪律分布，并在關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)了較好的連通特性。其中度值和介數(shù)超過平均值的有17個(gè)靶點(diǎn)，分別是：AKT1、TP53、MAPK3、CASP3、JUN、FOS、MAPK8、MYC、CAT、MAPK1、VEGFA、PTGS2、CREB1、EGFR、ILB1、SOD1和PPARG,認(rèn)為這17個(gè)靶點(diǎn)是六磨湯治療便秘的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。詳見圖2、表2。

2.4 相關(guān)通路信息和注釋分析 17個(gè)關(guān)鍵治療靶點(diǎn)經(jīng)David數(shù)據(jù)庫GO分析得出186個(gè)生物學(xué)過程(Biological Process，BP)，經(jīng)過Bonferroni校正P值<0.05，得到158個(gè)生物學(xué)過程，包括藥物反應(yīng)(response to drug)、脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)(negative regulation of apoptotic process)、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)、細(xì)胞對機(jī)械刺激的反應(yīng)(cellular response to mechanical stimulus)等。這些關(guān)鍵治療靶點(diǎn)涉及多種信號(hào)通路，取P<0.01,得到80條信號(hào)通路，包括結(jié)直腸癌信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等。如圖3、圖4所示。

表2 六磨湯治療便秘的潛在治療靶點(diǎn)拓?fù)鋵傩?/p>

續(xù)表2 表2 六磨湯治療便秘的潛在治療靶點(diǎn)拓?fù)鋵傩?/p>

2.5 分子對接驗(yàn)證 利用分子對接軟件和系統(tǒng)分子對接服務(wù)器將六磨湯的17個(gè)關(guān)鍵治療靶點(diǎn)與對應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對接，IGEMDICK軟件的分子對接結(jié)果是以能量的高低對化合物結(jié)合程度來判斷的，能量越低，化合物分子與受體結(jié)合的作用可能性越大。系統(tǒng)分子對接結(jié)果一般認(rèn)為Docking Score值大于4.25表示對接分子與靶點(diǎn)之間有一定的結(jié)合活性，大于5.0表明對接分子與靶點(diǎn)之間有較好的結(jié)合活性，大于7.0則說明具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，其中IL1B、EGFR、VEGFA、FOS、JUN和TP53由于沒有受體，所以無法與化合物對接。對接結(jié)果顯示分子對接得分大于5.0的有36個(gè)，大于7.0的有6個(gè)，結(jié)果見表3。表明六磨湯有效化合物進(jìn)入機(jī)體后能與靶蛋白穩(wěn)定結(jié)合，發(fā)揮治療作用。

續(xù)表3 表3 六磨湯關(guān)鍵作用靶點(diǎn)與六磨湯有效化合物的分子對接結(jié)果

3 討論

便秘是一種常見的、頑固的胃腸道疾病，嚴(yán)重影響著現(xiàn)代人們生活質(zhì)量。研究表明[9]，便秘的發(fā)病受多種腸道動(dòng)力與內(nèi)分泌因素的影響。研究發(fā)現(xiàn)[10-12]，便秘的發(fā)病機(jī)制主要與胃腸動(dòng)力障礙、腦-腸軸異常、神經(jīng)遞質(zhì)異常、Cajal間質(zhì)細(xì)胞異常、激素水平異常、腸道微生態(tài)失調(diào)、水通道蛋白異常、排便動(dòng)力學(xué)異常等密切相關(guān)。六磨湯為臨床上治療便秘有效方，能夠發(fā)揮調(diào)肝理脾、通便導(dǎo)滯的作用從而治療便秘，對改善患者臨床癥狀有明顯的療效，且副作用及并發(fā)癥較少，但治療的療效機(jī)制尚未十分明確[13-14]。

研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測篩選出六磨湯的有效化合物43個(gè)，這些有效化合物包括橙皮素、槲皮素、川陳皮素、豆甾醇、大黃酸、大黃素等，這些有效化合物具有潤腸通便、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、調(diào)節(jié)腸道動(dòng)力等作用。如譚舒舒等[15]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，枳殼中的橙皮苷能夠在腸道中被腸道菌群水解成橙皮素，發(fā)揮促進(jìn)小鼠小腸推進(jìn)的作用，從而起到行滯消脹的功效。大黃酸是一種廣泛存在于藥用植物大黃的親脂性蒽醌，是大黃起到瀉下通便作用的主要有效成分[16]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大黃蒽醌能夠經(jīng)過機(jī)體腸道菌群代謝后吸收后，調(diào)節(jié)血漿中胃動(dòng)素，減少便秘小鼠結(jié)腸黏膜水通道蛋白的表達(dá)發(fā)揮通便的作用[17-19]。張晉蔚等[20]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠降低結(jié)腸黏膜水通道蛋白的表達(dá)，減少對腸道內(nèi)容物水分的吸收，從而起到潤腸通便，緩解慢性傳輸性便秘癥狀的作用。檳榔堿是檳榔的主要有效成分，能興奮膽堿M3受體，具有興奮全胃腸道平滑肌的作用，改善腸道動(dòng)力從而治療便秘[21]。本研究利用數(shù)據(jù)庫分子反向?qū)宇A(yù)測出化合物的作用靶點(diǎn)，獲得了有效化合物的作用靶點(diǎn)116個(gè)，將六磨湯的六味藥、有效化合物及化合物的作用靶點(diǎn)進(jìn)行合并，可知六磨湯6味中藥含有多種化合物，每個(gè)化合物又有多個(gè)作用靶點(diǎn)，說明六磨湯具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，共同協(xié)同，從多環(huán)節(jié)發(fā)揮治療便秘的作用，如圖5所示。通過對作用靶點(diǎn)的拓?fù)浞治?、GO分析和KEGG分析，可以發(fā)現(xiàn)六磨湯的有效化合物能作用于多個(gè)位點(diǎn)共同參與相關(guān)的生物學(xué)過程，進(jìn)而改善便秘病癥，如FOS，CASP3，PTGS2和JUN這4個(gè)靶蛋白作用于腸道對脂多糖的反應(yīng)，AKT1，EGFR，CASP3，VEGFA，TP53，MAPK8，CAT，MYC共同調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，富集的信號(hào)通路多樣，如直腸癌信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、CMAP信號(hào)通路等，便秘的相關(guān)機(jī)制研究涉及這些通路。研究表明，靜脈注射血管活性腸肽(VIP)能調(diào)節(jié)大鼠腸道液代謝，進(jìn)而改善便秘癥狀，可能與VIP-camp-pka-aqp3信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)[22]。楊筱[23]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，通便湯能夠有效治療慢傳輸型便秘,其機(jī)制可能與其通過調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路，抑制MAPKs的表達(dá)，從而減低AQP3、AQP4表達(dá)有關(guān)。通過分子對接方法將六磨湯的有效化合物與作用靶點(diǎn)進(jìn)行對接，結(jié)果顯示結(jié)合度良好，說明六磨湯有效成分能在機(jī)體穩(wěn)定發(fā)揮治療作用。

研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接方法初步預(yù)測了六磨湯治療便秘的作用機(jī)制，六磨湯通過合理的配伍，各種有效成分協(xié)同作用于調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、誘導(dǎo)水通道蛋白的表達(dá)、細(xì)胞的代謝、蛋白磷酸化等各種生物學(xué)過程和MAPK、PI3K等不同的信號(hào)通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)胃腸收縮、調(diào)節(jié)腸道功能、潤腸通便等作用。本研究是基于大數(shù)據(jù)信息預(yù)測，具有一定的局限性，預(yù)測結(jié)果雖與當(dāng)前的一些研究相契合，但后期仍需經(jīng)過臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，進(jìn)一步揭示六磨湯治療的機(jī)制，闡述中醫(yī)行氣導(dǎo)滯通便理論的科學(xué)內(nèi)涵與中藥調(diào)節(jié)效應(yīng)的作用本質(zhì)具有現(xiàn)實(shí)意義。