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        染色體1q22區(qū)域遺傳變異影響胃癌易感性的生物學(xué)機(jī)制研究*

        2020-12-17 06:38:10顏財(cái)旺高志穎黃童童靳光付
        中國(guó)腫瘤臨床 2020年21期
        關(guān)鍵詞:關(guān)聯(lián)位點(diǎn)測(cè)序

        顏財(cái)旺 高志穎 黃童童 靳光付

        胃癌是一種慢性復(fù)雜性疾病,也是人類最常見的惡性腫瘤之一。在全世界范圍內(nèi),其發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第五位和第三位[1],而其中將近一半的新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在中國(guó)[2]。流行病學(xué)研究已表明,胃癌是環(huán)境因素與個(gè)體遺傳因素長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果。其中導(dǎo)致東亞地區(qū)胃癌高發(fā)的主要環(huán)境因素包括幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染[3]、攝入大量的腌制和硝化食品[4]以及煙草暴露[5]等。然而,不同的個(gè)體對(duì)環(huán)境暴露的反應(yīng)存在易感性差異,例如在H.pylori 感染者中,最終僅1%~2%的感染者會(huì)發(fā)展成為胃癌。這種易感性差異目前被認(rèn)為是由個(gè)體遺傳因素所決定的[6]。

        近十余年來(lái),全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-Wide Association Study,GWAS)已鑒定了10 余個(gè)胃癌遺傳易感位點(diǎn)[7-15]。其中,1q22為中國(guó)人群GWAS所鑒定的胃癌易感區(qū)域,研究證實(shí)該區(qū)域的易感位點(diǎn)rs4072037,其次要等位基因G 能夠顯著降低個(gè)體的胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[8]。近期,本研究組基于4 項(xiàng)胃癌GWAS的分析發(fā)現(xiàn)[15],與胃癌發(fā)生關(guān)聯(lián)效應(yīng)最強(qiáng)的遺傳變異為rs760077,該位點(diǎn)與rs4072037 存在高度連鎖,精細(xì)定位研究(fine-mapping)也提示該區(qū)域僅存在唯一的獨(dú)立關(guān)聯(lián)信號(hào),然而該區(qū)域影響胃癌發(fā)生的機(jī)制尚未完全闡明。因此,本研究旨在探索染色體1q22區(qū)域遺傳變異影響胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 生物信息學(xué)分析

        本研究通過(guò)Ensembl GRCh37 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://grch37.ensembl.org/index.html)獲得rs760077 上下游1Mb 范圍內(nèi)基因信息,并根據(jù)GTEx 公共數(shù)據(jù)庫(kù)(V8版本)(http://www.gtexportal.org/home/)中324 例正常胃組織的基因型和表達(dá)數(shù)據(jù),計(jì)算rs760077基因型與該范圍內(nèi)各基因表達(dá)水平之間的表達(dá)數(shù)量性狀基因座(expression of quantitative trait loci,eQTL)關(guān)系。此外,本課題組從腫瘤基因組圖譜計(jì)劃(The Cancer Genome Atlas,TCGA)網(wǎng)站下載了經(jīng)正態(tài)性轉(zhuǎn)化后的胃癌樣本基因表達(dá)(expectation maximization normalized read counts,RSEM)數(shù)據(jù),分析候選易感基因在胃癌組織和癌旁組織的差異表達(dá)情況。

        1.2 生物功能學(xué)實(shí)驗(yàn)

        在細(xì)胞水平,采用購(gòu)置于EXIQON公司的ASO敲低各胃癌細(xì)胞系GBAP1表達(dá),使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑檢測(cè)不同處理組細(xì)胞的增殖情況;同時(shí)以單克隆細(xì)胞生長(zhǎng)情況來(lái)反映不同處理組細(xì)胞的增殖情況。在小鼠水平,將5×106個(gè)對(duì)照組和敲低組細(xì)胞分別注射到裸鼠雙側(cè)腋下;隨后每隔3~4 天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積;待荷瘤3 周后,將裸鼠注射麻藥后拍攝總體成瘤情況照片,行頸椎脫臼法處死裸鼠后剝離皮下瘤組織;對(duì)剝離的各組腫瘤進(jìn)行拍照、稱重并記錄。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作均根據(jù)南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物政策與福利委員會(huì)準(zhǔn)則進(jìn)行。

        1.3 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及通路富集分析

        針對(duì)候選易感基因GBAP1,在胃癌細(xì)胞BGC823上,對(duì)敲降組和對(duì)照組(ASO敲降組和對(duì)照組三平行共6個(gè)樣本)提取總RNA并送至上海烈冰科技公司進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。利用HTSeq對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)化得到各組基因標(biāo)化表達(dá)(fragments per kilobase per million,F(xiàn)PKM)數(shù)據(jù)后,根據(jù)Fold Change值將上調(diào)大于1.5以及下調(diào)小于0.5,并且差異結(jié)果P值經(jīng)過(guò)False Discovery Rates(FDR)校正后小于0.05的基因,納入受GBAP1影響的候選差異表達(dá)基因并進(jìn)行通路富集分析。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        THBS3、GBA、GBAP1 基因差異表達(dá)計(jì)算采用Student′st檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)。本研究所有涉及的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果分析,并采用GraphPad Prism 6軟件繪圖,所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn),假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。統(tǒng)計(jì)分析使用R3.2.3和Plink1.9軟件完成。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

        2 結(jié)果

        2.1 染色體1q22區(qū)域候選易感基因的篩選

        本研究通過(guò)GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中324例正常胃組織的基因型和基因表達(dá)數(shù)據(jù),對(duì)rs760077及其上下游1Mb范圍內(nèi)的所有基因進(jìn)行eQTL 分析。如表1 所示,在72個(gè)基因中,THBS3、GBAP1、GBA、FAM189B、RP11-263K19.4、RUSC1-AS1、RP11-263K19.6、SYT11 和MTX1 等基因的表達(dá)水平與rs760077 基因型存在顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05),而僅與THBS3、GBAP1、GBA 基因的關(guān)聯(lián)達(dá)到Bonferroni 多重校正的標(biāo)準(zhǔn)(0.05/72,P<6.94×10-4),其中rs760077 的A 等位基因在顯著降低THBS3 表達(dá)的同時(shí)(P=1.20×10-21,圖1A),也能夠顯著增加GBA(P=1.80×10-4,圖1B)和GBAP1(P=3.49×10-17,圖1C)的表達(dá)水平,提示THBS3、GBA、GBAP1可能是1q22區(qū)域的候選易感基因。

        2.2 染色體1q22區(qū)域候選易感基因的功能學(xué)研究

        為探究候選易感基因THBS3、GBA 和GBAP1 在胃癌發(fā)生中的潛在作用,本研究首先基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌表達(dá)數(shù)據(jù),在胃癌組織和癌旁組織中對(duì)3個(gè)基因分別進(jìn)行配對(duì)和成組的差異表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論在配對(duì)還是成組分析中,THBS3 在胃癌組織和癌旁組織中均沒(méi)有明顯差異(圖1D,1G),而GBA和GBAP1 在胃癌組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),其中GBAP1 的差異更為顯著(圖1E,1F,1H,1I),提示GBAP1可能在胃癌發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

        為明確GBAP1的生物學(xué)功能,本研究通過(guò)ASO技術(shù)在胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901中敲低GBAP1,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,敲低組胃癌細(xì)胞增殖能力明顯減弱(圖2)。隨后,本研究利用慢病毒構(gòu)建的GBAP1穩(wěn)定低表達(dá)胃癌細(xì)胞株,進(jìn)行了裸鼠體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果再次表明,相較于對(duì)照組,兩組穩(wěn)定敲低組的細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤能力均顯著減弱(圖3),進(jìn)一步證實(shí)了GBAP1在胃癌發(fā)生中發(fā)揮的促癌基因作用。

        表1 在正常胃組織中rs760077基因型與周圍基因表達(dá)水平關(guān)聯(lián)

        2.3 染色體1q22 區(qū)域易感基因GBAP1 在胃癌發(fā)生中參與的下游機(jī)制

        為了深入探究GBAP1在胃癌發(fā)生中參與的下游機(jī)制,本研究在胃癌細(xì)胞敲低GBAP1 后進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,以Fold Change值上調(diào)>1.5以及下調(diào)<0.5,并且經(jīng)FDR校正后P<0.05為標(biāo)準(zhǔn),在GBAP1敲低組中共篩選出1 141個(gè)差異表達(dá)基因,包括表達(dá)明顯上調(diào)的401個(gè)基因和740個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)的基因(圖4A)。鑒于GBAP1 在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)并且促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖能力,因此本研究著重對(duì)與GBAP1存在正相關(guān)關(guān)系的基因(即在GBAP1 敲低組中表達(dá)顯著下調(diào)的740 個(gè)基因)進(jìn)行了后續(xù)通路富集分析。結(jié)果證實(shí)這些基因顯著富集于氨基酸生物合成及包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝和一碳代謝等多種代謝通路(圖4B),提示GBAP1能夠顯著改變腫瘤細(xì)胞的代謝合成途徑。

        本研究隨后針對(duì)同時(shí)參與這幾條代謝合成通路的關(guān)鍵酶基因PHGDH、PSAT1 和PSPH 進(jìn)行檢測(cè),證實(shí)GBAP1 在敲低后,這三個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)均顯著下降(圖4C)。此外,本研究利用TCGA胃癌組織表達(dá)數(shù)據(jù),也同樣發(fā)現(xiàn)GBAP1 的表達(dá)水平與PHGDH、PSAT1 和PSPH 的表達(dá)水平均存在正相關(guān)關(guān)系,其中與PHGDH 和PSPH 的關(guān)聯(lián)均達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水平(圖4D,4E,4F)。

        圖1 rs760077 基因型與THBS3、GBA、GBAP1 表達(dá)水平關(guān)聯(lián)及差異表達(dá)情況

        圖2 GBAP1 在胃癌細(xì)胞BGC823 和SGC7901中的體外表型

        圖3 GBAP1敲低的體內(nèi)荷瘤表型結(jié)果

        圖4 GBAP1的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及下游基因共表達(dá)

        3 討論

        盡管研究者們通過(guò)GWAS已成功鑒定了10余個(gè)胃癌遺傳易感位點(diǎn)[7-15],但相較于其他腫瘤(如肺癌、乳腺癌),胃癌目前發(fā)現(xiàn)的易感位點(diǎn)仍然較少,僅能解釋其中部分的遺傳性狀。此外,胃癌GWAS鑒定的易感遺傳變異絕大多數(shù)都位于染色體非編碼區(qū),受這些遺傳變異調(diào)控的易感基因仍有待進(jìn)一步探索[16]。針對(duì)易感區(qū)域,為尋找候選易感基因,研究者往往通過(guò)eQTL 分析,以無(wú)偏倚的方式評(píng)估易感位點(diǎn)與其周圍各基因表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)。例如,最近的一項(xiàng)研究顯示,在前列腺癌的100 個(gè)易感區(qū)域內(nèi),有40個(gè)區(qū)域的易感位點(diǎn)至少與所在區(qū)域的一個(gè)基因存在eQTL 關(guān)聯(lián);同時(shí)在63 個(gè)新發(fā)現(xiàn)的致病位點(diǎn)中,有35 個(gè)同樣存在一致的eQTL 關(guān)聯(lián)[17]。本研究針對(duì)染色體1q22 區(qū)域的eQTL 分析發(fā)現(xiàn),易感位點(diǎn)rs760077 的A 等位基因在顯著降低THBS3 表達(dá)的同時(shí),也能夠顯著增加GBA和GBAP1的表達(dá)水平,而與既往認(rèn)為是該區(qū)域易感基因的MUC1 表達(dá)無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(P=0.767),表明該區(qū)域的易感位點(diǎn)也可能通過(guò)影響GBA或GBAP1而發(fā)揮生物學(xué)作用。本研究通過(guò)后續(xù)差異表達(dá)分析和功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)GBAP1在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),并且能夠顯著增強(qiáng)胃癌的增殖能力,可能是該區(qū)域的真正致病性易感基因。

        GBAP1于1990年首次測(cè)序認(rèn)定為是葡萄糖基神經(jīng)酰胺酶β(GBA)的假基因[18],是一種不具備編碼能力的長(zhǎng)鏈RNA。Ma 等[19]從基因組甲基化角度出發(fā),證實(shí)位于GBAP1 啟動(dòng)子區(qū)的rs2990245 通過(guò)影響啟動(dòng)子甲基化水平從而調(diào)控GBAP1表達(dá)。鑒于該位點(diǎn)與本研究鑒定的獨(dú)立關(guān)聯(lián)位點(diǎn)rs760077存在高LD關(guān)系(r2=0.87),其可能是該區(qū)域的致病性功能位點(diǎn)。此外,該團(tuán)隊(duì)還證實(shí)GBAP1可以競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合miRNA-212-3p從而增加GBA的表達(dá),然而其未對(duì)GBAP1本身及其下游機(jī)制開展深入研究,僅采用GBAP1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞,證實(shí)GBAP1 可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖能力[19]。與該結(jié)果一致,本研究通過(guò)ASO和shRNA方法從細(xì)胞系和裸鼠體內(nèi)兩方面系統(tǒng)驗(yàn)證了GBAP1在胃癌發(fā)生中的促癌作用。

        越來(lái)越多的證據(jù)表明氨基酸合成代謝是腫瘤細(xì)胞維持其活性并進(jìn)一步增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵通路[20-22]。其中,3-磷酸甘油酸脫氫酶(PHGDH)[23]、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶1(PSAT1)[24]和磷酸絲氨酸磷酸酶(PSPH)[25],是氨基酸合成代謝的關(guān)鍵酶,參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[26-28]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序證實(shí),受GBAP1 影響的基因顯著富集于氨基酸生物合成及包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝和一碳代謝等多種代謝通路,并且其能夠調(diào)控PHGDH、PSAT1和PSPH的表達(dá)水平。因此,GBAP1可能是通過(guò)影響氨基酸合成代謝通路從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖能力。

        綜上所述,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),染色體1q22區(qū)域的易感位點(diǎn)可能通過(guò)調(diào)控易感基因GBAP1 表達(dá),促進(jìn)關(guān)鍵酶基因PHGDH、PSAT1 和PSPH 的表達(dá)水平,從而激活絲氨酸等氨基酸合成代謝通路,增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力,并最終促進(jìn)了胃癌的發(fā)生。本研究是對(duì)既往研究的深入探索,進(jìn)一步明確了染色體1q22 區(qū)域的易感機(jī)制,為胃癌的早期預(yù)防和診斷提供了重要線索。然而,本研究也存在一些不足之處:首先,本研究基于GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)中歐美人群的正常胃組織數(shù)據(jù)進(jìn)行了eQTL分析,由于人群間存在異質(zhì)性,后續(xù)需要利用中國(guó)人群的數(shù)據(jù)進(jìn)行深入研究;其次,本研究初步揭示了GBAP1在胃癌發(fā)生中的作用及潛在的生物學(xué)機(jī)制,但其確切的下游機(jī)制及其對(duì)胃癌相關(guān)危險(xiǎn)因素的應(yīng)答機(jī)制仍需進(jìn)一步的深入研究。

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