顏財(cái)旺 高志穎 黃童童 靳光付

胃癌是一種慢性復(fù)雜性疾病，也是人類最常見的惡性腫瘤之一。在全世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第五位和第三位［1］，而其中將近一半的新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在中國(guó)［2］。流行病學(xué)研究已表明，胃癌是環(huán)境因素與個(gè)體遺傳因素長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果。其中導(dǎo)致東亞地區(qū)胃癌高發(fā)的主要環(huán)境因素包括幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染［3］、攝入大量的腌制和硝化食品［4］以及煙草暴露［5］等。然而，不同的個(gè)體對(duì)環(huán)境暴露的反應(yīng)存在易感性差異，例如在H.pylori 感染者中，最終僅1%～2%的感染者會(huì)發(fā)展成為胃癌。這種易感性差異目前被認(rèn)為是由個(gè)體遺傳因素所決定的［6］。

近十余年來(lái)，全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome-Wide Association Study，GWAS）已鑒定了10 余個(gè)胃癌遺傳易感位點(diǎn)［7-15］。其中，1q22為中國(guó)人群GWAS所鑒定的胃癌易感區(qū)域，研究證實(shí)該區(qū)域的易感位點(diǎn)rs4072037，其次要等位基因G 能夠顯著降低個(gè)體的胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［8］。近期，本研究組基于4 項(xiàng)胃癌GWAS的分析發(fā)現(xiàn)［15］，與胃癌發(fā)生關(guān)聯(lián)效應(yīng)最強(qiáng)的遺傳變異為rs760077，該位點(diǎn)與rs4072037 存在高度連鎖，精細(xì)定位研究（fine-mapping）也提示該區(qū)域僅存在唯一的獨(dú)立關(guān)聯(lián)信號(hào)，然而該區(qū)域影響胃癌發(fā)生的機(jī)制尚未完全闡明。因此，本研究旨在探索染色體1q22區(qū)域遺傳變異影響胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

本研究通過(guò)Ensembl GRCh37 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//grch37.ensembl.org/index.html）獲得rs760077 上下游1Mb 范圍內(nèi)基因信息，并根據(jù)GTEx 公共數(shù)據(jù)庫(kù)（V8版本）（http：//www.gtexportal.org/home/）中324 例正常胃組織的基因型和表達(dá)數(shù)據(jù)，計(jì)算rs760077基因型與該范圍內(nèi)各基因表達(dá)水平之間的表達(dá)數(shù)量性狀基因座（expression of quantitative trait loci，eQTL）關(guān)系。此外，本課題組從腫瘤基因組圖譜計(jì)劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）網(wǎng)站下載了經(jīng)正態(tài)性轉(zhuǎn)化后的胃癌樣本基因表達(dá)（expectation maximization normalized read counts，RSEM）數(shù)據(jù)，分析候選易感基因在胃癌組織和癌旁組織的差異表達(dá)情況。

1.2 生物功能學(xué)實(shí)驗(yàn)

在細(xì)胞水平，采用購(gòu)置于EXIQON公司的ASO敲低各胃癌細(xì)胞系GBAP1表達(dá)，使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑檢測(cè)不同處理組細(xì)胞的增殖情況；同時(shí)以單克隆細(xì)胞生長(zhǎng)情況來(lái)反映不同處理組細(xì)胞的增殖情況。在小鼠水平，將5×106個(gè)對(duì)照組和敲低組細(xì)胞分別注射到裸鼠雙側(cè)腋下；隨后每隔3～4 天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積；待荷瘤3 周后，將裸鼠注射麻藥后拍攝總體成瘤情況照片，行頸椎脫臼法處死裸鼠后剝離皮下瘤組織；對(duì)剝離的各組腫瘤進(jìn)行拍照、稱重并記錄。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作均根據(jù)南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物政策與福利委員會(huì)準(zhǔn)則進(jìn)行。

1.3 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及通路富集分析

針對(duì)候選易感基因GBAP1，在胃癌細(xì)胞BGC823上，對(duì)敲降組和對(duì)照組（ASO敲降組和對(duì)照組三平行共6個(gè)樣本）提取總RNA并送至上海烈冰科技公司進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。利用HTSeq對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)化得到各組基因標(biāo)化表達(dá)（fragments per kilobase per million，F(xiàn)PKM）數(shù)據(jù)后，根據(jù)Fold Change值將上調(diào)大于1.5以及下調(diào)小于0.5，并且差異結(jié)果P值經(jīng)過(guò)False Discovery Rates（FDR）校正后小于0.05的基因，納入受GBAP1影響的候選差異表達(dá)基因并進(jìn)行通路富集分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

THBS3、GBA、GBAP1 基因差異表達(dá)計(jì)算采用Student′st檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)。本研究所有涉及的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果分析，并采用GraphPad Prism 6軟件繪圖，所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。統(tǒng)計(jì)分析使用R3.2.3和Plink1.9軟件完成。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 染色體1q22區(qū)域候選易感基因的篩選

本研究通過(guò)GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中324例正常胃組織的基因型和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，對(duì)rs760077及其上下游1Mb范圍內(nèi)的所有基因進(jìn)行eQTL 分析。如表1 所示，在72個(gè)基因中，THBS3、GBAP1、GBA、FAM189B、RP11-263K19.4、RUSC1-AS1、RP11-263K19.6、SYT11 和MTX1 等基因的表達(dá)水平與rs760077 基因型存在顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.05），而僅與THBS3、GBAP1、GBA 基因的關(guān)聯(lián)達(dá)到Bonferroni 多重校正的標(biāo)準(zhǔn)（0.05/72，P＜6.94×10-4），其中rs760077 的A 等位基因在顯著降低THBS3 表達(dá)的同時(shí)（P=1.20×10-21，圖1A），也能夠顯著增加GBA（P=1.80×10-4，圖1B）和GBAP1（P=3.49×10-17，圖1C）的表達(dá)水平，提示THBS3、GBA、GBAP1可能是1q22區(qū)域的候選易感基因。

2.2 染色體1q22區(qū)域候選易感基因的功能學(xué)研究

為探究候選易感基因THBS3、GBA 和GBAP1 在胃癌發(fā)生中的潛在作用，本研究首先基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌表達(dá)數(shù)據(jù)，在胃癌組織和癌旁組織中對(duì)3個(gè)基因分別進(jìn)行配對(duì)和成組的差異表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論在配對(duì)還是成組分析中，THBS3 在胃癌組織和癌旁組織中均沒(méi)有明顯差異（圖1D,1G），而GBA和GBAP1 在胃癌組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，其中GBAP1 的差異更為顯著（圖1E，1F，1H，1I），提示GBAP1可能在胃癌發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

為明確GBAP1的生物學(xué)功能，本研究通過(guò)ASO技術(shù)在胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901中敲低GBAP1，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，敲低組胃癌細(xì)胞增殖能力明顯減弱（圖2）。隨后，本研究利用慢病毒構(gòu)建的GBAP1穩(wěn)定低表達(dá)胃癌細(xì)胞株，進(jìn)行了裸鼠體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果再次表明，相較于對(duì)照組，兩組穩(wěn)定敲低組的細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤能力均顯著減弱（圖3），進(jìn)一步證實(shí)了GBAP1在胃癌發(fā)生中發(fā)揮的促癌基因作用。

表1 在正常胃組織中rs760077基因型與周圍基因表達(dá)水平關(guān)聯(lián)

2.3 染色體1q22 區(qū)域易感基因GBAP1 在胃癌發(fā)生中參與的下游機(jī)制

為了深入探究GBAP1在胃癌發(fā)生中參與的下游機(jī)制，本研究在胃癌細(xì)胞敲低GBAP1 后進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，以Fold Change值上調(diào)＞1.5以及下調(diào)＜0.5，并且經(jīng)FDR校正后P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，在GBAP1敲低組中共篩選出1 141個(gè)差異表達(dá)基因，包括表達(dá)明顯上調(diào)的401個(gè)基因和740個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)的基因（圖4A）。鑒于GBAP1 在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)并且促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖能力，因此本研究著重對(duì)與GBAP1存在正相關(guān)關(guān)系的基因（即在GBAP1 敲低組中表達(dá)顯著下調(diào)的740 個(gè)基因）進(jìn)行了后續(xù)通路富集分析。結(jié)果證實(shí)這些基因顯著富集于氨基酸生物合成及包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝和一碳代謝等多種代謝通路（圖4B），提示GBAP1能夠顯著改變腫瘤細(xì)胞的代謝合成途徑。

本研究隨后針對(duì)同時(shí)參與這幾條代謝合成通路的關(guān)鍵酶基因PHGDH、PSAT1 和PSPH 進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)GBAP1 在敲低后，這三個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)均顯著下降（圖4C）。此外，本研究利用TCGA胃癌組織表達(dá)數(shù)據(jù)，也同樣發(fā)現(xiàn)GBAP1 的表達(dá)水平與PHGDH、PSAT1 和PSPH 的表達(dá)水平均存在正相關(guān)關(guān)系，其中與PHGDH 和PSPH 的關(guān)聯(lián)均達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水平（圖4D，4E，4F）。

圖1 rs760077 基因型與THBS3、GBA、GBAP1 表達(dá)水平關(guān)聯(lián)及差異表達(dá)情況

圖2 GBAP1 在胃癌細(xì)胞BGC823 和SGC7901中的體外表型

圖3 GBAP1敲低的體內(nèi)荷瘤表型結(jié)果

圖4 GBAP1的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及下游基因共表達(dá)

3 討論

盡管研究者們通過(guò)GWAS已成功鑒定了10余個(gè)胃癌遺傳易感位點(diǎn)［7-15］，但相較于其他腫瘤（如肺癌、乳腺癌），胃癌目前發(fā)現(xiàn)的易感位點(diǎn)仍然較少，僅能解釋其中部分的遺傳性狀。此外，胃癌GWAS鑒定的易感遺傳變異絕大多數(shù)都位于染色體非編碼區(qū)，受這些遺傳變異調(diào)控的易感基因仍有待進(jìn)一步探索［16］。針對(duì)易感區(qū)域，為尋找候選易感基因，研究者往往通過(guò)eQTL 分析，以無(wú)偏倚的方式評(píng)估易感位點(diǎn)與其周圍各基因表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)。例如，最近的一項(xiàng)研究顯示，在前列腺癌的100 個(gè)易感區(qū)域內(nèi)，有40個(gè)區(qū)域的易感位點(diǎn)至少與所在區(qū)域的一個(gè)基因存在eQTL 關(guān)聯(lián)；同時(shí)在63 個(gè)新發(fā)現(xiàn)的致病位點(diǎn)中，有35 個(gè)同樣存在一致的eQTL 關(guān)聯(lián)［17］。本研究針對(duì)染色體1q22 區(qū)域的eQTL 分析發(fā)現(xiàn)，易感位點(diǎn)rs760077 的A 等位基因在顯著降低THBS3 表達(dá)的同時(shí)，也能夠顯著增加GBA和GBAP1的表達(dá)水平，而與既往認(rèn)為是該區(qū)域易感基因的MUC1 表達(dá)無(wú)顯著關(guān)聯(lián)（P=0.767），表明該區(qū)域的易感位點(diǎn)也可能通過(guò)影響GBA或GBAP1而發(fā)揮生物學(xué)作用。本研究通過(guò)后續(xù)差異表達(dá)分析和功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)GBAP1在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，并且能夠顯著增強(qiáng)胃癌的增殖能力，可能是該區(qū)域的真正致病性易感基因。

GBAP1于1990年首次測(cè)序認(rèn)定為是葡萄糖基神經(jīng)酰胺酶β（GBA）的假基因［18］，是一種不具備編碼能力的長(zhǎng)鏈RNA。Ma 等［19］從基因組甲基化角度出發(fā)，證實(shí)位于GBAP1 啟動(dòng)子區(qū)的rs2990245 通過(guò)影響啟動(dòng)子甲基化水平從而調(diào)控GBAP1表達(dá)。鑒于該位點(diǎn)與本研究鑒定的獨(dú)立關(guān)聯(lián)位點(diǎn)rs760077存在高LD關(guān)系（r2=0.87），其可能是該區(qū)域的致病性功能位點(diǎn)。此外，該團(tuán)隊(duì)還證實(shí)GBAP1可以競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合miRNA-212-3p從而增加GBA的表達(dá)，然而其未對(duì)GBAP1本身及其下游機(jī)制開展深入研究，僅采用GBAP1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，證實(shí)GBAP1 可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖能力［19］。與該結(jié)果一致，本研究通過(guò)ASO和shRNA方法從細(xì)胞系和裸鼠體內(nèi)兩方面系統(tǒng)驗(yàn)證了GBAP1在胃癌發(fā)生中的促癌作用。

越來(lái)越多的證據(jù)表明氨基酸合成代謝是腫瘤細(xì)胞維持其活性并進(jìn)一步增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵通路［20-22］。其中，3-磷酸甘油酸脫氫酶（PHGDH）［23］、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶1（PSAT1）［24］和磷酸絲氨酸磷酸酶（PSPH）［25］，是氨基酸合成代謝的關(guān)鍵酶，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［26-28］。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序證實(shí)，受GBAP1 影響的基因顯著富集于氨基酸生物合成及包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝和一碳代謝等多種代謝通路，并且其能夠調(diào)控PHGDH、PSAT1和PSPH的表達(dá)水平。因此，GBAP1可能是通過(guò)影響氨基酸合成代謝通路從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖能力。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染色體1q22區(qū)域的易感位點(diǎn)可能通過(guò)調(diào)控易感基因GBAP1 表達(dá)，促進(jìn)關(guān)鍵酶基因PHGDH、PSAT1 和PSPH 的表達(dá)水平，從而激活絲氨酸等氨基酸合成代謝通路，增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，并最終促進(jìn)了胃癌的發(fā)生。本研究是對(duì)既往研究的深入探索，進(jìn)一步明確了染色體1q22 區(qū)域的易感機(jī)制，為胃癌的早期預(yù)防和診斷提供了重要線索。然而，本研究也存在一些不足之處：首先，本研究基于GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)中歐美人群的正常胃組織數(shù)據(jù)進(jìn)行了eQTL分析，由于人群間存在異質(zhì)性，后續(xù)需要利用中國(guó)人群的數(shù)據(jù)進(jìn)行深入研究；其次，本研究初步揭示了GBAP1在胃癌發(fā)生中的作用及潛在的生物學(xué)機(jī)制，但其確切的下游機(jī)制及其對(duì)胃癌相關(guān)危險(xiǎn)因素的應(yīng)答機(jī)制仍需進(jìn)一步的深入研究。