顏財旺 高志穎 黃童童 靳光付

胃癌是一種慢性復(fù)雜性疾病，也是人類最常見的惡性腫瘤之一。在全世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第五位和第三位［1］，而其中將近一半的新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在中國［2］。流行病學研究已表明，胃癌是環(huán)境因素與個體遺傳因素長期相互作用的結(jié)果。其中導(dǎo)致東亞地區(qū)胃癌高發(fā)的主要環(huán)境因素包括幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染［3］、攝入大量的腌制和硝化食品［4］以及煙草暴露［5］等。然而，不同的個體對環(huán)境暴露的反應(yīng)存在易感性差異，例如在H.pylori 感染者中，最終僅1%～2%的感染者會發(fā)展成為胃癌。這種易感性差異目前被認為是由個體遺傳因素所決定的［6］。

近十余年來，全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome-Wide Association Study，GWAS）已鑒定了10 余個胃癌遺傳易感位點［7-15］。其中，1q22為中國人群GWAS所鑒定的胃癌易感區(qū)域，研究證實該區(qū)域的易感位點rs4072037，其次要等位基因G 能夠顯著降低個體的胃癌發(fā)病風險［8］。近期，本研究組基于4 項胃癌GWAS的分析發(fā)現(xiàn)［15］，與胃癌發(fā)生關(guān)聯(lián)效應(yīng)最強的遺傳變異為rs760077，該位點與rs4072037 存在高度連鎖，精細定位研究（fine-mapping）也提示該區(qū)域僅存在唯一的獨立關(guān)聯(lián)信號，然而該區(qū)域影響胃癌發(fā)生的機制尚未完全闡明。因此，本研究旨在探索染色體1q22區(qū)域遺傳變異影響胃癌發(fā)生風險的機制。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析

本研究通過Ensembl GRCh37 數(shù)據(jù)庫（http：//grch37.ensembl.org/index.html）獲得rs760077 上下游1Mb 范圍內(nèi)基因信息，并根據(jù)GTEx 公共數(shù)據(jù)庫（V8版本）（http：//www.gtexportal.org/home/）中324 例正常胃組織的基因型和表達數(shù)據(jù)，計算rs760077基因型與該范圍內(nèi)各基因表達水平之間的表達數(shù)量性狀基因座（expression of quantitative trait loci，eQTL）關(guān)系。此外，本課題組從腫瘤基因組圖譜計劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）網(wǎng)站下載了經(jīng)正態(tài)性轉(zhuǎn)化后的胃癌樣本基因表達（expectation maximization normalized read counts，RSEM）數(shù)據(jù)，分析候選易感基因在胃癌組織和癌旁組織的差異表達情況。

1.2 生物功能學實驗

在細胞水平，采用購置于EXIQON公司的ASO敲低各胃癌細胞系GBAP1表達，使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑檢測不同處理組細胞的增殖情況；同時以單克隆細胞生長情況來反映不同處理組細胞的增殖情況。在小鼠水平，將5×106個對照組和敲低組細胞分別注射到裸鼠雙側(cè)腋下；隨后每隔3～4 天用游標卡尺測量腫瘤體積；待荷瘤3 周后，將裸鼠注射麻藥后拍攝總體成瘤情況照片，行頸椎脫臼法處死裸鼠后剝離皮下瘤組織；對剝離的各組腫瘤進行拍照、稱重并記錄。本研究動物實驗得到南京醫(yī)科大學倫理委員會的批準，所有動物實驗相關(guān)操作均根據(jù)南京醫(yī)科大學動物政策與福利委員會準則進行。

1.3 全轉(zhuǎn)錄組測序及通路富集分析

針對候選易感基因GBAP1，在胃癌細胞BGC823上，對敲降組和對照組（ASO敲降組和對照組三平行共6個樣本）提取總RNA并送至上海烈冰科技公司進行全轉(zhuǎn)錄組測序。利用HTSeq對測序數(shù)據(jù)進行標化得到各組基因標化表達（fragments per kilobase per million，F(xiàn)PKM）數(shù)據(jù)后，根據(jù)Fold Change值將上調(diào)大于1.5以及下調(diào)小于0.5，并且差異結(jié)果P值經(jīng)過False Discovery Rates（FDR）校正后小于0.05的基因，納入受GBAP1影響的候選差異表達基因并進行通路富集分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

THBS3、GBA、GBAP1 基因差異表達計算采用Student′st檢驗和配對t檢驗。本研究所有涉及的細胞實驗均重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標準差的形式表示，用兩獨立樣本t檢驗進行結(jié)果分析，并采用GraphPad Prism 6軟件繪圖，所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗，假設(shè)檢驗水準α=0.05。統(tǒng)計分析使用R3.2.3和Plink1.9軟件完成。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義

2 結(jié)果

2.1 染色體1q22區(qū)域候選易感基因的篩選

本研究通過GTEx數(shù)據(jù)庫中324例正常胃組織的基因型和基因表達數(shù)據(jù)，對rs760077及其上下游1Mb范圍內(nèi)的所有基因進行eQTL 分析。如表1 所示，在72個基因中，THBS3、GBAP1、GBA、FAM189B、RP11-263K19.4、RUSC1-AS1、RP11-263K19.6、SYT11 和MTX1 等基因的表達水平與rs760077 基因型存在顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.05），而僅與THBS3、GBAP1、GBA 基因的關(guān)聯(lián)達到Bonferroni 多重校正的標準（0.05/72，P＜6.94×10-4），其中rs760077 的A 等位基因在顯著降低THBS3 表達的同時（P=1.20×10-21，圖1A），也能夠顯著增加GBA（P=1.80×10-4，圖1B）和GBAP1（P=3.49×10-17，圖1C）的表達水平，提示THBS3、GBA、GBAP1可能是1q22區(qū)域的候選易感基因。

2.2 染色體1q22區(qū)域候選易感基因的功能學研究

為探究候選易感基因THBS3、GBA 和GBAP1 在胃癌發(fā)生中的潛在作用，本研究首先基于TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌表達數(shù)據(jù)，在胃癌組織和癌旁組織中對3個基因分別進行配對和成組的差異表達分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論在配對還是成組分析中，THBS3 在胃癌組織和癌旁組織中均沒有明顯差異（圖1D,1G），而GBA和GBAP1 在胃癌組織中均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，其中GBAP1 的差異更為顯著（圖1E，1F，1H，1I），提示GBAP1可能在胃癌發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。

為明確GBAP1的生物學功能，本研究通過ASO技術(shù)在胃癌細胞系BGC823和SGC7901中敲低GBAP1，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，敲低組胃癌細胞增殖能力明顯減弱（圖2）。隨后，本研究利用慢病毒構(gòu)建的GBAP1穩(wěn)定低表達胃癌細胞株，進行了裸鼠體內(nèi)荷瘤實驗。結(jié)果再次表明，相較于對照組，兩組穩(wěn)定敲低組的細胞在裸鼠皮下成瘤能力均顯著減弱（圖3），進一步證實了GBAP1在胃癌發(fā)生中發(fā)揮的促癌基因作用。

表1 在正常胃組織中rs760077基因型與周圍基因表達水平關(guān)聯(lián)

2.3 染色體1q22 區(qū)域易感基因GBAP1 在胃癌發(fā)生中參與的下游機制

為了深入探究GBAP1在胃癌發(fā)生中參與的下游機制，本研究在胃癌細胞敲低GBAP1 后進行了全轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，以Fold Change值上調(diào)＞1.5以及下調(diào)＜0.5，并且經(jīng)FDR校正后P＜0.05為標準，在GBAP1敲低組中共篩選出1 141個差異表達基因，包括表達明顯上調(diào)的401個基因和740個表達顯著下調(diào)的基因（圖4A）。鑒于GBAP1 在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)并且促進胃癌細胞增殖能力，因此本研究著重對與GBAP1存在正相關(guān)關(guān)系的基因（即在GBAP1 敲低組中表達顯著下調(diào)的740 個基因）進行了后續(xù)通路富集分析。結(jié)果證實這些基因顯著富集于氨基酸生物合成及包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝和一碳代謝等多種代謝通路（圖4B），提示GBAP1能夠顯著改變腫瘤細胞的代謝合成途徑。

本研究隨后針對同時參與這幾條代謝合成通路的關(guān)鍵酶基因PHGDH、PSAT1 和PSPH 進行檢測，證實GBAP1 在敲低后，這三個關(guān)鍵酶基因的表達均顯著下降（圖4C）。此外，本研究利用TCGA胃癌組織表達數(shù)據(jù)，也同樣發(fā)現(xiàn)GBAP1 的表達水平與PHGDH、PSAT1 和PSPH 的表達水平均存在正相關(guān)關(guān)系，其中與PHGDH 和PSPH 的關(guān)聯(lián)均達到統(tǒng)計學檢驗水平（圖4D，4E，4F）。

圖1 rs760077 基因型與THBS3、GBA、GBAP1 表達水平關(guān)聯(lián)及差異表達情況

圖2 GBAP1 在胃癌細胞BGC823 和SGC7901中的體外表型

圖3 GBAP1敲低的體內(nèi)荷瘤表型結(jié)果

圖4 GBAP1的轉(zhuǎn)錄組測序及下游基因共表達

3 討論

盡管研究者們通過GWAS已成功鑒定了10余個胃癌遺傳易感位點［7-15］，但相較于其他腫瘤（如肺癌、乳腺癌），胃癌目前發(fā)現(xiàn)的易感位點仍然較少，僅能解釋其中部分的遺傳性狀。此外，胃癌GWAS鑒定的易感遺傳變異絕大多數(shù)都位于染色體非編碼區(qū)，受這些遺傳變異調(diào)控的易感基因仍有待進一步探索［16］。針對易感區(qū)域，為尋找候選易感基因，研究者往往通過eQTL 分析，以無偏倚的方式評估易感位點與其周圍各基因表達水平之間的關(guān)聯(lián)。例如，最近的一項研究顯示，在前列腺癌的100 個易感區(qū)域內(nèi)，有40個區(qū)域的易感位點至少與所在區(qū)域的一個基因存在eQTL 關(guān)聯(lián)；同時在63 個新發(fā)現(xiàn)的致病位點中，有35 個同樣存在一致的eQTL 關(guān)聯(lián)［17］。本研究針對染色體1q22 區(qū)域的eQTL 分析發(fā)現(xiàn)，易感位點rs760077 的A 等位基因在顯著降低THBS3 表達的同時，也能夠顯著增加GBA和GBAP1的表達水平，而與既往認為是該區(qū)域易感基因的MUC1 表達無顯著關(guān)聯(lián)（P=0.767），表明該區(qū)域的易感位點也可能通過影響GBA或GBAP1而發(fā)揮生物學作用。本研究通過后續(xù)差異表達分析和功能學實驗證實GBAP1在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，并且能夠顯著增強胃癌的增殖能力，可能是該區(qū)域的真正致病性易感基因。

GBAP1于1990年首次測序認定為是葡萄糖基神經(jīng)酰胺酶β（GBA）的假基因［18］，是一種不具備編碼能力的長鏈RNA。Ma 等［19］從基因組甲基化角度出發(fā)，證實位于GBAP1 啟動子區(qū)的rs2990245 通過影響啟動子甲基化水平從而調(diào)控GBAP1表達。鑒于該位點與本研究鑒定的獨立關(guān)聯(lián)位點rs760077存在高LD關(guān)系（r2=0.87），其可能是該區(qū)域的致病性功能位點。此外，該團隊還證實GBAP1可以競爭性的結(jié)合miRNA-212-3p從而增加GBA的表達，然而其未對GBAP1本身及其下游機制開展深入研究，僅采用GBAP1 過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細胞，證實GBAP1 可以促進胃癌細胞的增殖能力［19］。與該結(jié)果一致，本研究通過ASO和shRNA方法從細胞系和裸鼠體內(nèi)兩方面系統(tǒng)驗證了GBAP1在胃癌發(fā)生中的促癌作用。

越來越多的證據(jù)表明氨基酸合成代謝是腫瘤細胞維持其活性并進一步增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵通路［20-22］。其中，3-磷酸甘油酸脫氫酶（PHGDH）［23］、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶1（PSAT1）［24］和磷酸絲氨酸磷酸酶（PSPH）［25］，是氨基酸合成代謝的關(guān)鍵酶，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［26-28］。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序證實，受GBAP1 影響的基因顯著富集于氨基酸生物合成及包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝和一碳代謝等多種代謝通路，并且其能夠調(diào)控PHGDH、PSAT1和PSPH的表達水平。因此，GBAP1可能是通過影響氨基酸合成代謝通路從而促進胃癌細胞的增殖能力。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染色體1q22區(qū)域的易感位點可能通過調(diào)控易感基因GBAP1 表達，促進關(guān)鍵酶基因PHGDH、PSAT1 和PSPH 的表達水平，從而激活絲氨酸等氨基酸合成代謝通路，增強細胞增殖能力，并最終促進了胃癌的發(fā)生。本研究是對既往研究的深入探索，進一步明確了染色體1q22 區(qū)域的易感機制，為胃癌的早期預(yù)防和診斷提供了重要線索。然而，本研究也存在一些不足之處：首先，本研究基于GTEx 數(shù)據(jù)庫中歐美人群的正常胃組織數(shù)據(jù)進行了eQTL分析，由于人群間存在異質(zhì)性，后續(xù)需要利用中國人群的數(shù)據(jù)進行深入研究；其次，本研究初步揭示了GBAP1在胃癌發(fā)生中的作用及潛在的生物學機制，但其確切的下游機制及其對胃癌相關(guān)危險因素的應(yīng)答機制仍需進一步的深入研究。