白日蘭 崔久嵬

腫瘤異質(zhì)性［1］指腫瘤演進過程中分子生物學(xué)或基因方面發(fā)生改變，從而使不同腫瘤細胞的生長速度、侵襲能力、對藥物的敏感性等產(chǎn)生差異，是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個普遍而又至關(guān)重要的表現(xiàn)特征，是腫瘤賴以生存和進一步演進的重要狀態(tài)和支撐點，也是近年來通過不斷探索發(fā)現(xiàn)的一個關(guān)鍵理論和認(rèn)識。目前，腫瘤異質(zhì)性方面研究取得諸多新進展，包括對其內(nèi)在規(guī)律、時空和組成成分的復(fù)雜性、形成機制等均有新的突破。

腫瘤異質(zhì)性不僅可影響診斷，同時也對治療、療效和疾病監(jiān)測、耐藥性和預(yù)后等產(chǎn)生影響。對其深入分析有助于揭示腫瘤動態(tài)演進過程，包括從對腫瘤形態(tài)異質(zhì)性的認(rèn)識到分子機制的逐步揭示。腫瘤異質(zhì)性與臨床診治密切相關(guān)，是實現(xiàn)精準(zhǔn)診治及攻克腫瘤的重大挑戰(zhàn)。在這個過程中，隨著高通量測序［2］和單細胞測序技術(shù)［3］的發(fā)展和不斷完善，已在空間或時間上實現(xiàn)對不同區(qū)域腫瘤的單個細胞或全基因組進行深度測序，逐步揭示腫瘤異質(zhì)性的相應(yīng)理論和分子機制，并進一步促進對其形成規(guī)律、腫瘤演進過程的新認(rèn)識。腫瘤異質(zhì)性的組成及影響，見圖1。

1 腫瘤異質(zhì)性的復(fù)雜性

1.1 腫瘤的時空異質(zhì)性

患者在不同階段出現(xiàn)的腫瘤，可能面臨不同的生物選擇壓力，使得個體遺傳多樣性隨時間動態(tài)發(fā)生變化，稱為時間異質(zhì)性［4］。例如，與早期腫瘤相比，晚期腫瘤可能因營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，缺氧生存策略的選擇似乎更強，如侵襲和血管生成能力增強［5-6］。另一方面，具有遺傳多樣性的腫瘤亞群在單個疾病部位內(nèi)或不同疾病部位之間分布不均，稱為空間異質(zhì)性［4，7］。前者指原發(fā)病灶內(nèi)部可包含多個位置上分離、分子上不同的細胞亞群，后者指腫瘤細胞在特定轉(zhuǎn)移部位的遺傳組成與原發(fā)腫瘤或其他轉(zhuǎn)移部位不同。而局部區(qū)域和遠處腫瘤細胞即使來源相同，也會因局部微環(huán)境，如氧合、營養(yǎng)豐度、免疫活性和基質(zhì)組成等因素的相互作用使不同部位腫瘤產(chǎn)生遺傳差異。因此，腫瘤異質(zhì)性存在時空變異，可影響腫瘤的發(fā)展、免疫細胞進入腫瘤及對治療的反應(yīng)性。

圖1 腫瘤異質(zhì)性的組成及影響

1.2 腫瘤組成成分的異質(zhì)性

1.2.1 腫瘤細胞間異質(zhì)性 腫瘤細胞內(nèi)部不同腫瘤細胞間存在異質(zhì)性，如不同驅(qū)動突變腫瘤細胞的共存現(xiàn)象，其相互作用可更好地維持腫瘤異質(zhì)性的平衡狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）vⅢ缺失突變型腫瘤克隆可通過旁分泌機制分泌白細胞介素6 和白血病抑制因子維持野生型EGFR（wild-type EGFR，WT-EGFR）克隆的生長和活化，維持了腫瘤異質(zhì)性［8］。Hobor等［9］發(fā)現(xiàn)，使用抗西妥昔單抗的結(jié)直腸癌中，EGFR抑制劑抗性細胞（KRAS 突變型）可通過旁分泌方式分泌轉(zhuǎn)化生長因子α 和雙調(diào)蛋白維持WT-KRAS 型藥物敏感性細胞的生長。此外，腫瘤內(nèi)部一些細胞可表現(xiàn)為干細胞樣特性，可通過建立分化等級產(chǎn)生細胞異質(zhì)性，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)存在一系列不同的細胞類型［10-11］；還可以在單個腫瘤內(nèi)分化為代謝和功能不同的亞克隆，維持腫瘤內(nèi)部組成成分的異質(zhì)性［12］。

1.2.2 腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境間異質(zhì)性 除腫瘤細胞間異質(zhì)性外，腫瘤細胞與其周圍微環(huán)境間相互作用亦會導(dǎo)致腫瘤異質(zhì)性，促進腫瘤進展。首先，腫瘤組織中存在氧分布異質(zhì)性，進而導(dǎo)致線粒體分布異質(zhì)性。有研究發(fā)現(xiàn)，低氧可通過激活SIAH2-NRF1軸下調(diào)線粒體相關(guān)核編碼基因的表達并抑制線粒體活性，導(dǎo)致“Warburg”效應(yīng)增強、腫瘤代謝重編程、腫瘤相關(guān)巨噬細胞極化并促腫瘤免疫反應(yīng)，從而重塑并營造適宜生存的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME），維持并促進腫瘤進展［13］。其次，微環(huán)境中血管的不同分布可影響腫瘤細胞的空間分布［14］。在腫瘤細胞和巨噬細胞的空間分布模型中，因代謝由與血管間的距離驅(qū)動［15］，氧利用率隨著與血管間的距離增加而降低，使得腫瘤細胞更依賴于產(chǎn)生乳酸的無氧糖酵解。而高乳酸濃度對巨噬細胞的存活不利，因此遠離血管的腫瘤組織巨噬細胞較少。治療過程中藥物濃度分布受到血管的距離、局部纖維化和組織結(jié)構(gòu)的其他特征影響，而進一步影響腫瘤細胞的空間分布［16］。此外，TME 中免疫細胞浸潤程度存在顯著的區(qū)域差異，且腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用的復(fù)雜性可能有助于腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（intra-tumor heterogeneity，ITH）的形成。一項研究對71個肝細胞癌樣本檢測發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞純度最低的區(qū)域是免疫細胞浸潤程度最高的區(qū)域；使用RNA 測序數(shù)據(jù)測量的腫瘤浸潤淋巴細胞負(fù)荷和克隆性、區(qū)域新表位變異和潛在的病毒輔助因子信號均可顯著增加臨床相關(guān)ITH的范圍和價值［17］。

綜上所述，腫瘤異質(zhì)性具有復(fù)雜性、多樣性的特點。而近年來發(fā)展的單細胞測序技術(shù)，能夠分離空間或時間上不同腫瘤區(qū)域混合群體中單個細胞，使研究者從多個維度逐步了解腫瘤組成成分的復(fù)雜性和時空多變性，是探索腫瘤進化的有效、新興測序方法［18-19］。

2 腫瘤異質(zhì)性的形成機制和起源模型

腫瘤異質(zhì)性的形成機制十分復(fù)雜，可由遺傳、轉(zhuǎn)錄組、表觀遺傳學(xué)等的變化共同導(dǎo)致。本文重點關(guān)注基因組不穩(wěn)定性在促進遺傳多樣性和細胞異質(zhì)性方面的重要作用，以及表觀遺傳學(xué)對腫瘤進化和異質(zhì)性形成的影響。目前，為進一步解釋腫瘤異質(zhì)性起源和克隆多樣性的維持，已建立各種模型，雖然任一單一理論模型均無法全面地闡述腫瘤異質(zhì)性的起源，但這些模型并非相互排斥，而是共同作用以創(chuàng)建一個復(fù)雜的動態(tài)平衡系統(tǒng)。

2.1 腫瘤異質(zhì)性的形成機制

2.1.1 基因組不穩(wěn)定性促進遺傳多樣性和細胞異質(zhì)性 基因組不穩(wěn)定性是遺傳多樣性和體細胞異質(zhì)性發(fā)生的重要機制之一［20-21］，可由端粒損傷、DNA 錯配修復(fù)缺陷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等內(nèi)源性因素引起［22-23］，使腫瘤細胞更容易發(fā)生突變而促進腫瘤異質(zhì)性。載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化多肽（apolipoprotein B mRNA- editing enzyme catalytic- polypeptide，APOBEC）家族成員是導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性的一個重要因素。其在炎癥因子和相關(guān)修復(fù)通路失衡的作用下可造成人體基因組損傷，持續(xù)引發(fā)大量體細胞突變，為基因進化提供了足夠變異基數(shù)［24-25］。與APOBEC 胞苷脫氨酶活性相關(guān)的體細胞拷貝數(shù)改變（somatic copy-number alteration，SCNA）、易位和突變均存在明顯的ITH，成為腫瘤多樣性的內(nèi)源性驅(qū)動力［26］。

2.1.2 表觀遺傳學(xué)影響腫瘤進化和異質(zhì)性的形成遺傳異質(zhì)性不能完整解釋腫瘤表型的多樣性，表觀遺傳學(xué)修飾可在不改變DNA序列基礎(chǔ)的前提下下調(diào)控基因的活性，影響腫瘤進化和異質(zhì)性形成及發(fā)展［10，27］。在分子水平上，DNA 甲基化、組蛋白翻譯后修飾、非編碼RNA、組蛋白變異和染色質(zhì)重塑等均可對基因表達、細胞功能和表型產(chǎn)生影響［28］。如組蛋白甲基化修飾可在具有自我更新能力的腫瘤干細胞樣細胞（cancer stem like cell，CSLC）和已分化的細胞間實現(xiàn)細胞可塑性，促進耐藥性腫瘤克隆的局部生長［10］。表觀遺傳ITH與遺傳變異相關(guān)，基因組和表觀基因組間的復(fù)雜作用有助于單個腫瘤產(chǎn)生表型異質(zhì)性。有研究表明，體細胞突變可能是早期致癌事件，而DNA甲基化改變顯著地促進了腫瘤后期的分支進化［29］。也有證據(jù)表明，遺傳和表觀遺傳事件可能是腫瘤克隆走向進展的獨立影響因素，如黑色素瘤中觀察到細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A/B基因座的缺失和基因高甲基化是相互排斥的事件，均與腦轉(zhuǎn)移時間更短有關(guān)［30］。

2.2 腫瘤異質(zhì)性的起源模型

2.2.1 腫瘤克隆進化模型 在克隆進化模型中，基因組不穩(wěn)定性的隨機突變的積累可導(dǎo)致遺傳多樣性的增加，隨著時間的推移，腫瘤會獲得具有不同基因型的亞克隆并在隨后的選擇驅(qū)動下保留優(yōu)勢腫瘤亞群?？寺∵M化模型有以下幾個理論模式：分支進化模型將每個測序的腫瘤細胞中鑒定出的突變視為腫瘤體細胞進化樹的主干，而僅存在于部分腫瘤細胞中的亞克隆突變視為分支［31-33］；另一個為“大爆發(fā)”模型，將基因組變異的獲得描述為突然的、離散的突變爆發(fā)或“災(zāi)難性”染色體事件［34-35］，如染色體碎裂［36］，認(rèn)為這些大量基因組事件通常發(fā)生在腫瘤早期，而后期沒有選擇；中性進化理論則認(rèn)為在早期致癌階段，癌前細胞被反復(fù)選擇和消除，而在后期建立的腫瘤細胞克隆中發(fā)生的額外突變是中性的［37］。

2.2.2 腫瘤干細胞模型 腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）模型認(rèn)為腫瘤細胞中異質(zhì)性的重要來源是CSC，只有這些腫瘤細胞具有無限的自我更新能力，與腫瘤的發(fā)生和長期生存維持相關(guān)［38］。CSC 可通過建立分化等級產(chǎn)生細胞異質(zhì)性，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)存在一系列不同的細胞類型［10］；還能夠在單個腫瘤內(nèi)分化為代謝和功能不同的亞克隆，對腫瘤異質(zhì)性的形成至關(guān)重要［12］。對于腫瘤干性細胞的形成過程，目前有兩種觀點：一種理論認(rèn)為腫瘤中原本就存在少數(shù)CSC，并在隨后腫瘤進化過程中逐漸形成優(yōu)勢克??；另一種假設(shè)認(rèn)為，異質(zhì)性腫瘤細胞群可通過表觀遺傳修飾等原因促進腫瘤干性重編程［10］進而使其成為易突變細胞，即CSLC。這些細胞隨后可獲得穩(wěn)定表達耐藥基因的特征，進一步促進腫瘤異質(zhì)性的形成和維持［39］。

綜上所述，腫瘤在多種因素共同作用下演進成為一個復(fù)雜、動態(tài)的細胞混合體。腫瘤內(nèi)部各組分間互相作用，一方面可引起不同代謝表型改變，另一方面可改變TME異質(zhì)性；同時，微環(huán)境對腫瘤細胞的壓力可使其內(nèi)部組分發(fā)生適應(yīng)性改變，最終形成一種動態(tài)、穩(wěn)定的異質(zhì)性生物狀態(tài)。

3 腫瘤異質(zhì)性對腫瘤演進的影響

3.1 促進腫瘤進展

由于腫瘤進展過程中基因突變、選擇壓力的時間變化，早期腫瘤和晚期腫瘤間基因表達和組成成分呈現(xiàn)出異質(zhì)性，使其能夠在復(fù)雜多變的環(huán)境中更好地適應(yīng)和生存。多任務(wù)進化理論模型顯示［14］，早期腫瘤最接近細胞分裂、生物量和能量產(chǎn)生原型，而晚期腫瘤更接近免疫相互作用、侵襲和血管生成、組織重建原型［5］。腫瘤細胞分布的空間異質(zhì)性也有利于其轉(zhuǎn)移和進展。如在乳腺腫瘤中，腫瘤中心細胞表達的標(biāo)志物與增殖較弱和靜態(tài)表型相關(guān)（如編碼碳酸酐酶Ⅻ、缺氧誘導(dǎo)因子等），而周邊細胞的侵襲和增殖標(biāo)志物上調(diào)，以促進腫瘤向周邊及血管侵襲和轉(zhuǎn)移［40］。多任務(wù)進化理論同時也提出組織性能最大化理論，認(rèn)為腫瘤的選擇是建立在總體組織性能水平上的，表現(xiàn)為在選擇權(quán)衡過程中不同腫瘤細胞具有不同的分工［14］，如在轉(zhuǎn)移中，由不同細胞專責(zé)改變細胞外基質(zhì)、募集血管、促進腫瘤移入血管等［41］。因此，ITH 和空間結(jié)構(gòu)在促進腫瘤生存、不斷進展過程中發(fā)揮重要作用。

3.2 促進腫瘤耐藥的形成

腫瘤異質(zhì)性亞群可在藥物的環(huán)境壓力下被篩選或形成藥物耐受細胞，這種腫瘤異質(zhì)性狀態(tài)是腫瘤克服藥物壓力得以生存、并進一步形成耐藥優(yōu)勢克隆的基礎(chǔ)和保障。藥物耐受細胞的形成機制除耐藥基因突變外，非突變機制主要支持以下3 種模型［42］：1）達爾文選擇模型認(rèn)為，在抗腫瘤治療前腫瘤中存在少數(shù)藥物耐受細胞，這些細胞在藥物治療的選擇后富集［43］；2）Lamarkian誘導(dǎo)假設(shè)認(rèn)為，藥物難治性表型細胞由來自異質(zhì)性腫瘤細胞群經(jīng)治療后的表觀遺傳修飾形成，殘留病灶中可出現(xiàn)幾種藥物耐受狀態(tài)細胞共存現(xiàn)象［44］；3）以上兩種情況并不互斥，即治療前部分腫瘤細胞可能動態(tài)表達各種耐藥基因，而在治療時表達高水平耐藥基因的少數(shù)細胞存活并進行了重編程，以穩(wěn)定表達耐藥基因特征，最終形成耐藥細胞群［45］。

靶向治療進程中，腫瘤異質(zhì)性所致的耐藥相關(guān)基因突變的異質(zhì)性更為復(fù)雜。如不同患者間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）基因耐藥突變位點的差異，如G1202R、G1269A、L1196M、I1171T 及F1174C 等［46］；或同一患者多種不同耐藥位點的共突變，如G1269A、F1174L、E1154Q 及E1210K四種耐藥位點共突變［47］；以及ALK 與EGFR-L858R共突變等現(xiàn)象［48］?；诖?，靶向多個信號通路的聯(lián)合抗腫瘤策略或可減少腫瘤耐藥的發(fā)生。

4 腫瘤異質(zhì)性對臨床診治的挑戰(zhàn)

4.1 影響腫瘤臨床診斷和疾病監(jiān)測

由于腫瘤時空進化和動態(tài)演進的連續(xù)性，使得瘤灶內(nèi)、瘤灶間細胞和基因變異存在高度異質(zhì)性和快速演進的特點，為實現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)診斷帶來挑戰(zhàn)［49-51］。一項研究分析了61 例非小細胞肺癌經(jīng)TKI治療發(fā)生耐藥后的表型轉(zhuǎn)化，其中小細胞肺癌、鱗狀細胞癌、大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肉瘤的病例均有報道［52］。因此，單次診斷性病理活檢并不能準(zhǔn)確、全面體現(xiàn)腫瘤動態(tài)變化的特征。另外，治療過程中對腫瘤整體狀態(tài)的實時、動態(tài)監(jiān)測至關(guān)重要，而腫瘤異質(zhì)性也使其存在挑戰(zhàn)，如療效評價時出現(xiàn)敏感病灶緩解，而不敏感病灶的大小無變化甚至出現(xiàn)進展的現(xiàn)象。

多區(qū)域活檢雖可提高確定腫瘤空間異質(zhì)性程度的能力［53-54］，但其風(fēng)險較高，尚未得到廣泛應(yīng)用。近年來，能夠全面反應(yīng)腫瘤異質(zhì)性并監(jiān)測腫瘤治療療效的技術(shù)不斷發(fā)展，如液體活檢、第二代測序（nextgeneration sequencing，NGS）、單細胞測序技術(shù)等，可更準(zhǔn)確、方便的追蹤腫瘤進展和治療反應(yīng)。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤細胞、外泌體等液體活檢技術(shù)在預(yù)測治療反應(yīng)性、早期診斷疾病復(fù)發(fā)、實時動態(tài)監(jiān)測腫瘤進化等方面具有重要研究價值［55］，如多次或多時間點對腫瘤進行連續(xù)液體活檢以確定不同表型，或聯(lián)合單細胞測序技術(shù)實現(xiàn)更精準(zhǔn)分析。TRACERx 研究基于多區(qū)域、動態(tài)采樣，使用NGS 檢測腫瘤組織和ctDNA 基因譜改變，可對ITH進行動態(tài)監(jiān)測，并揭示腫瘤進化模式，基于此的診療模式目前正在探索性研究階段［56］。

4.2 影響腫瘤臨床治療和預(yù)后

腫瘤異質(zhì)性使得患者面臨更多的治療選擇，問題在于是否可在治療前預(yù)測療效，從而篩選出更有效的治療手段。近期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤突變負(fù)荷和拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）的高低對患者的生存率無顯著影響，而ITH更低的患者免疫反應(yīng)和生存率明顯高于ITH 高的患者。隨后在黑色素瘤細胞系中驗證了該結(jié)果并提出可能解釋：ITH高的腫瘤內(nèi)亞克隆上的新生抗原被稀釋，不足以引起抗腫瘤免疫反應(yīng)［57］。

腫瘤ITH不僅可影響治療，更對腫瘤整體命運起決定性作用，在腫瘤發(fā)展和患者預(yù)后評估中至關(guān)重要。腫瘤ITH預(yù)示著腫瘤發(fā)展方向的多元化，患者的預(yù)后通常更差。Jama等［49］的研究中，CNV變化大（亞克隆拷貝數(shù)變化＞48%）與較差的臨床結(jié)果相關(guān)；對12 種腫瘤的研究顯示，當(dāng)同一腫瘤同時存在兩個以上克隆時，死亡風(fēng)險增加，但四個以上克隆共存時死亡風(fēng)險反而降低，表明ITH 水平可顯著影響患者結(jié)局［58］；基于NGS 數(shù)據(jù)的遺傳ITH 定量測量-突變等位基因腫瘤ITH，已開發(fā)并應(yīng)用于頭頸部鱗狀細胞癌，研究發(fā)現(xiàn)這種新的腫瘤遺傳ITH 指標(biāo)與腫瘤進展和不良治療結(jié)局顯著相關(guān)［59］。

5 結(jié)語

腫瘤異質(zhì)性在腫瘤形成、發(fā)展和耐藥方面具有重要作用，目前已受到研究者廣泛關(guān)注。對腫瘤異質(zhì)性的揭示過程仍存在諸多挑戰(zhàn)。首先，雖然單細胞測序技術(shù)的進一步發(fā)展使研究者能夠更好地認(rèn)識腫瘤內(nèi)部細胞組成，但對其空間結(jié)構(gòu)的揭示尚不全面。如何全面、多角度地了解患者時空異質(zhì)性變化是未來腫瘤研究的方向之一；其次，液體活檢技術(shù)雖可動態(tài)、整體監(jiān)測腫瘤變化，但仍存在諸多技術(shù)方面的限制，需進一步提高其敏感性和特異性；再者，目前尚缺乏深入探索腫瘤異質(zhì)性和動態(tài)演進過程的動物模型，阻礙了對其規(guī)律的模擬研究。

未來，單細胞測序的發(fā)展與新開發(fā)的計算工具相結(jié)合，可以更精準(zhǔn)地揭示腫瘤演化，并闡明遺傳和表觀遺傳腫瘤異質(zhì)性的潛在分子機制。今后研究中，應(yīng)尋找腫瘤異質(zhì)性形成的上游和共同機制，在無序、分散的網(wǎng)絡(luò)機制中尋找有序、共性的調(diào)控分子，以阻斷腫瘤異質(zhì)性的形成和演進（如APOBEC抑制劑可從腫瘤信號通路上游抑制腫瘤突變的形成進而抑制腫瘤異質(zhì)性克隆的形成）；同時，進一步闡明維持腫瘤異質(zhì)性的細胞間互相作用的分子機制，為打破其網(wǎng)絡(luò)平衡提供分子基礎(chǔ)水平的支持。