孫淑珍，田中偉，鄭巧梅，孫傳蛟，孫建云

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物生理生態(tài)與生產(chǎn)管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇南京 210095； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，江蘇南京 210095)

鉻是水環(huán)境和土壤環(huán)境中最常見(jiàn)的重金屬污染物之一。目前，我國(guó)約有0.2億hm2耕地受鉻等重金屬的污染[1]。Cr6+是自然環(huán)境中最常見(jiàn)且穩(wěn)定的形式，有很強(qiáng)的移動(dòng)性和不可降解性，極易對(duì)植物造成傷害，并可通過(guò)食物鏈不斷富集，進(jìn)而危害人體健康，因此，Cr6+對(duì)植物的影響逐漸成為人們的研究熱點(diǎn)[2]。

小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要糧食作物之一，其種子萌發(fā)質(zhì)量的高低是影響產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。有研究表明，種子萌發(fā)時(shí)對(duì)Cr6+脅迫十分敏感，主要表現(xiàn)為種子內(nèi)α-淀粉酶構(gòu)象受損，活性降低[3]，糖和蛋白質(zhì)代謝發(fā)生紊亂[4]，大量活性氧生成，破壞膜脂并造成氧化損傷[5]，導(dǎo)致種子萌發(fā)率明顯下降。因此，保證小麥種子在Cr6+污染環(huán)境中正常萌發(fā)、出苗，是維持其產(chǎn)量平穩(wěn)的前提。添加適合的外源調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠提高重金屬脅迫下種子的萌發(fā)率，降低重金屬在其植株可食部位的積累[6]。前人已有報(bào)道證實(shí)，葡萄籽提取物(grape seed extract，GSE)[7]、氯化血紅素(hematin chloride，Hemin)[8]和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)[9]可有效緩解動(dòng)植物重金屬脅迫，但它們對(duì)Cr6+脅迫下植物生長(zhǎng)的影響及其相應(yīng)機(jī)制仍不明確。且已有研究只限于外施一種調(diào)節(jié)物質(zhì)，而未比較分析多種調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)同一植物在Cr6+脅迫下的緩解效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制上的差異。本研究利用水培試驗(yàn)在小麥種子萌發(fā)期分別添加GSE、Hemin和MeJA，探討這3種物質(zhì)對(duì)Cr6+毒害下小麥生理反應(yīng)的影響，以期明確它們?cè)诰徑釩r6+毒害、提高發(fā)芽率和出苗率等方面的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)為三因素(小麥品種、Cr6+濃度、調(diào)節(jié)物質(zhì)種類(lèi))設(shè)計(jì)。根據(jù)Xu等[10]的小麥耐Cr6+性篩選結(jié)果，選取豫麥51(敏感型)和揚(yáng)麥16(耐鉻型)為供試材料。小麥種子用20%的雙氧水消毒10 min后，迅速用蒸餾水清洗數(shù)次，均勻擺放至鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)。Cr6+處理濃度設(shè)0和100 μmol·L-1兩個(gè)水平，Cr6+以重鉻酸鉀(K2Cr2O7)的形式溶于蒸餾水或?qū)?yīng)濃度調(diào)節(jié)物質(zhì)中。調(diào)節(jié)物質(zhì)設(shè)100 μmol·L-1GSE、50 μmol·L-1Hemin、 1 μmol·L-1MeJA三個(gè)處理，以上處理濃度均由預(yù)試驗(yàn)篩選得出，以蒸餾水為對(duì)照(CK)。每個(gè)處理設(shè)置10個(gè)重復(fù)(每皿50粒，一個(gè)培養(yǎng)皿為一個(gè)重復(fù))，小麥種子置于 24 ℃/16 ℃(12 h/12 h)光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

種子萌發(fā)3 d時(shí)，取種子鮮樣測(cè)定α-淀粉酶活性。處理7 d時(shí)，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率并取鮮樣和干樣，同時(shí)在每個(gè)處理和每個(gè)培養(yǎng)皿里隨機(jī)取20顆發(fā)芽的小麥種子，測(cè)定根系和芽長(zhǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)Cr6+脅迫下小麥種子萌發(fā)的影響

由表1可知，在無(wú)Cr6+脅迫的情況下，添加調(diào)節(jié)物質(zhì)，兩品種的各指標(biāo)均無(wú)明顯差異。Cr6+脅迫顯著抑制了小麥種子的萌發(fā)以及萌發(fā)后幼苗的生長(zhǎng)。主要表現(xiàn)為，與無(wú)Cr6+脅迫處理下的對(duì)照相比，豫麥51種子萌發(fā)時(shí)的發(fā)芽率、根系干物質(zhì)積累量、地上部干物質(zhì)積累量、根長(zhǎng)和株高分別降低了25.9%、37.0%、25.0%、35.8%和 29.6%；揚(yáng)麥16分別下降了13.9%、27.8%、 19.0%、23.5%和21.8%。與Cr6+脅迫處理下的對(duì)照相比，分別添加GSE、Hemin和MeJA后，豫麥51和揚(yáng)麥16的上述指標(biāo)均顯著上升，其中添加GSE后，豫麥51和揚(yáng)麥16的發(fā)芽率分別上升了25.4%和10.7%，Hemin處理后分別上升了24.9%和7.3%，MeJA處理后分別上升了 15.8%和6.3%。上述結(jié)果表明，外源調(diào)節(jié)物質(zhì)可減輕Cr6+脅迫對(duì)小麥種子萌發(fā)的毒害作用，促進(jìn)Cr6+脅迫下小麥種子的萌發(fā)與生長(zhǎng)。

表1 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)Cr6+脅迫下小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect of exogenous regulators on seed germination and seedling growth of wheat under Cr6+ stress

2.2 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)Cr6+脅迫下小麥種子α-淀粉酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由表2可知，Cr6+脅迫顯著降低了小麥種子的α-淀粉酶活性，與無(wú)Cr6+脅迫處理下的對(duì)照相比，豫麥51降低了25.7%，揚(yáng)麥16降低了 20.0%。與Cr6+脅迫處理下的對(duì)照相比，添加GSE、Hemin和MeJA均顯著提高了小麥種子α-淀粉酶的活性，其中豫麥51分別提高了25.5%、 23.6%和14.5%，揚(yáng)麥16分別提高了20.0%、11.7%和5.0%。表明外源調(diào)節(jié)物質(zhì)可通過(guò)提高α-淀粉酶活性，誘導(dǎo)小麥種子在Cr6+脅迫下快速打破休眠。

在無(wú)Cr6+脅迫的情況下，添加調(diào)節(jié)物質(zhì)后，兩個(gè)小麥品種根系中可溶性糖含量均顯著提高。Cr6+脅迫顯著提高了兩品種根系中可溶性糖含量，且揚(yáng)麥16遠(yuǎn)高于豫麥51。而與Cr6+脅迫處理下的對(duì)照相比，分別添加GSE、Hemin和MeJA后，豫麥51可溶性糖含量分別提高了9.6%、26.0%和 27.2%；揚(yáng)麥16添加Hemin后可溶性糖含量提高了13.1%，而添加GSE和MeJA分別下降了22.7%和14.9%。Cr6+脅迫處理下，兩小麥品種根系中可溶性蛋白含量顯著增加，添加調(diào)節(jié)物質(zhì)后其含量進(jìn)一步增加 。與Cr6+脅迫處理下的對(duì)照相比，添加GSE、Hemin和MeJA后，豫麥51根系中可溶性蛋白含量分別提高了 10.5%、2.5%和8.9%，揚(yáng)麥16分別提高了 19.5%、14.7%和10.3%。表明外源調(diào)節(jié)物質(zhì)在一定程度可增強(qiáng)小麥根系的滲透調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)能力。

2.3 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)Cr6+脅迫下小麥根系MDA及活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量的影響

由表3可知，在無(wú)Cr6+脅迫的情況下，添加調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)小麥根系MDA的含量無(wú)明顯影響。Cr6+脅迫顯著提高了兩小麥品種根系MDA的含量，其中豫麥51根系MDA含量的升高幅度顯著大于揚(yáng)麥16。與Cr6+脅迫處理下的對(duì)照相比，添加調(diào)節(jié)物質(zhì)后，兩小麥品種根系MDA的含量均顯著降低。在外源添加GSE后，小麥根系MDA含量下降幅度最大，其次是Hemin，最后為MeJA。

表2 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)Cr6+脅迫下小麥種子α-淀粉酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Table 2 Effect of exogenous regulators on alpha-amylase activity and osmotic adjustment substance content of wheat seed under Cr6+ stress

表3 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)Cr6+脅迫下小麥根系和H2O2含量的影響Table 3 Effect of exogenous regulators on and H2O2 content of wheat root under Cr6+ stress

2.4 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)Cr6+脅迫下小麥根系抗氧化酶活性的影響

由表4可知，與無(wú)Cr6+脅迫處理下的對(duì)照相比，Cr6+脅迫顯著影響了兩個(gè)小麥品種根系被測(cè)抗氧化酶的活性，其中豫麥51根系的SOD和CAT活性顯著降低，APX和GR活性顯著增加；揚(yáng)麥16根系的SOD活性也呈降低趨勢(shì)，但其下降幅度低于豫麥51，根系其他抗氧化酶活性均顯著增加。與Cr6+脅迫處理下的對(duì)照相比，添加GSE、Hemin和MeJA后，兩個(gè)小麥品種根系的SOD、CAT、APX和GR活性均顯著上升(揚(yáng)麥16添加Hemin后的GR活性除外)。表明外源調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠通過(guò)提高小麥根系抗氧化酶的活性，清除由Cr6+產(chǎn)生的過(guò)量ROS ，維持細(xì)胞內(nèi)部ROS穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而提高小麥種子對(duì)Cr6+脅迫的適應(yīng)性。

表4 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)Cr6+脅迫下小麥根系抗氧化酶活性的影響Table 4 Effect of exogenous regulators on antioxidase activity of wheat root under Cr6+ stress

3 討 論

Cr6+對(duì)土壤和水系的長(zhǎng)期污染嚴(yán)重抑制了植物種子的萌發(fā)。本研究中，Cr6+脅迫對(duì)小麥種子萌發(fā)期的毒害癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)芽率降低、干物質(zhì)積累量減少等，這與Velez等[19]對(duì)鷹嘴豆的研究結(jié)論一致。Cr6+脅迫對(duì)兩小麥品種根系的毒害作用遠(yuǎn)大于對(duì)芽，可能是由于Cr6+直接接觸小麥根系，大量的Cr6+與細(xì)胞結(jié)合滯留于根部，導(dǎo)致ROS的大量生成，從而引發(fā)了細(xì)胞代謝受阻和細(xì)胞凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與Cr6+脅迫處理下的對(duì)照相比，外源同時(shí)添加調(diào)節(jié)物質(zhì)后，兩小麥品種發(fā)芽率、干物質(zhì)積累量、根長(zhǎng)和株高均顯著增加，增加幅度依次為GSE>Hemin>MeJA。α-淀粉酶活性的高低影響種子萌發(fā)的速度。本研究發(fā)現(xiàn)，Cr6+脅迫顯著降低了兩小麥品種種子內(nèi)α-淀粉酶的活性，進(jìn)而使種子內(nèi)淀粉水解速度變慢。原因可能是，α-淀粉酶是Ca2+依賴(lài)性酶[21]，高濃度Cr6+進(jìn)入種子內(nèi)部與Ca2+競(jìng)爭(zhēng)淀粉酶活性位點(diǎn)，致使α-淀粉酶的構(gòu)象發(fā)生變化，限制小麥種子萌發(fā)。與Cr6+脅迫處理下的對(duì)照相比，添加3種調(diào)節(jié)物質(zhì)后，小麥種子的α-淀粉酶活性均有不同程度的上升，其中添加GSE的酶活性與無(wú)Cr6+脅迫處理下的對(duì)照差異最小。這可能是外源調(diào)節(jié)物質(zhì)降低了Cr6+脅迫下小麥根系的氧化應(yīng)激，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，從而維持小麥生理生化穩(wěn)態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)Cr6+脅迫的情況下，添加調(diào)節(jié)物質(zhì)后，兩小麥品種根系內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白含量均增加(豫麥51添加GSE后的可溶性蛋白含量除外)。這表明外源調(diào)節(jié)物質(zhì)有利于小麥胚乳內(nèi)淀粉和蛋白質(zhì)的水解，為種子萌發(fā)供應(yīng)了豐富的物質(zhì)合成碳架。Cr6+脅迫下小麥根系的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)顯著增加，表明小麥種子萌發(fā)對(duì)Cr6+脅迫具有自我調(diào)節(jié)能力。添加外源調(diào)節(jié)物質(zhì)后，小麥根系的可溶性糖和可溶性蛋白含量進(jìn)一步增加，這表明外源調(diào)節(jié)物質(zhì)有利于小麥進(jìn)一步提高這種自我調(diào)節(jié)能力，有助于緩解Cr6+脅迫下由于膜結(jié)構(gòu)破壞而引起的滲透壓不平衡，使小麥根系保持相對(duì)較低的水勢(shì)，能從脅迫環(huán)境中吸收更多水分和養(yǎng)分，進(jìn)而促進(jìn)萌發(fā)后小麥幼苗的生長(zhǎng)，這與Handa等[6]對(duì)芥菜的研究結(jié)果一致。而略有不同的是，在Cr6+脅迫下，外源添加GSE和MeJA后，揚(yáng)麥16根系可溶性糖含量下降，推測(cè)是由于揚(yáng)麥16的耐Cr6+性較豫麥51強(qiáng)，在外源添加GSE和MeJA后，滲透脅迫降低，造成根系可溶性糖含量減少，也有可能是不同緩解物質(zhì)對(duì)不同品種小麥的緩解效應(yīng)不同導(dǎo)致。

4 結(jié) 論

Cr6+脅迫通過(guò)抑制淀粉酶活性，打破植株滲透平衡和加劇氧化損傷，從而抑制了小麥種子的萌發(fā)。添加調(diào)節(jié)物質(zhì)可以有效增強(qiáng)小麥的耐Cr6+性，主要表現(xiàn)在：提高小麥種子萌發(fā)期α-淀粉酶活性，增加種子萌發(fā)過(guò)程中的能量物質(zhì)供應(yīng)；調(diào)節(jié)小麥幼苗根系可溶性糖以及可溶性蛋白的含量，保證滲透穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)小麥萌發(fā)過(guò)程中的各種代謝；提高根系抗氧化酶活性，降低氧化應(yīng)激，最終緩解Cr6+脅迫。外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)Cr6+脅迫的緩解效果為GSE>Hemin>MeJA。