趙永濤，張 鋒，張中州，袁 謙，甄士聰，望俊森

（漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南漯河 462300）

根據(jù)小麥胚乳質(zhì)地可將小麥劃分為硬質(zhì)小麥、軟質(zhì)小麥和混合小麥。小麥籽粒硬度影響小麥的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和加工品質(zhì)，是評(píng)價(jià)小麥品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。軟質(zhì)麥蛋白質(zhì)含量低，磨出的面粉顆粒小，適合做饅頭、餅干、糕點(diǎn)等；硬質(zhì)麥蛋白質(zhì)含量高，磨出的面粉顆粒較大，吸水能力強(qiáng)，適合做面包、優(yōu)質(zhì)面條等[1]。角質(zhì)率在同一環(huán)境下可以大致反映籽粒硬度，角質(zhì)率越高，籽粒硬度越高[2]。

小麥籽粒硬度主要由位于5D 染色體短臂上的主效基因Pina（Puroindoline a）和Pinb控制。夏蘭芹等[3]開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的分子標(biāo)記并克隆了Pina和Pinb基因。籽粒硬度差異主要由Pina和Pinb基因的不同變異類(lèi)型造成。含有野生型Pina和Pinb基因的籽粒表現(xiàn)為軟質(zhì)，Pina和Pinb基因任何一個(gè)發(fā)生突變，籽粒便表現(xiàn)為混合型或硬質(zhì)。對(duì)籽粒硬度基因的研究主要采用分子標(biāo)記和序列分析，近年來(lái)，KASP(Kompetitive allele specific PCR)技術(shù)也逐漸應(yīng)用到小麥籽粒硬度基因分析中。KASP 可在廣泛的基因組DNA 樣品中，對(duì)單核苷酸多態(tài)性（SNP）或特定位點(diǎn)上的插入或缺失（InDel）進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因判定[4]。KASP 可應(yīng)用于QTL 精細(xì)定位、種子質(zhì)量控制、大樣本量的分子標(biāo)記驗(yàn)證、分子輔助育種、種子資源鑒定等方面，可以在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確判斷分子標(biāo)記類(lèi)型[5?7]。利用KASP 可以方便地篩選出小麥有利性狀基因，并指導(dǎo)后續(xù)品種改良，也可以對(duì)已改良品種進(jìn)行基因驗(yàn)證[8]。

豫麥158 由漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育，于2014 年通過(guò)國(guó)家農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定，該品種具有高產(chǎn)、綜合抗性較好、品質(zhì)較好等優(yōu)點(diǎn)[9?10]。豫麥158-42 為豫麥158 的自然變異系，其籽粒硬度增加，加工品質(zhì)得到較大改善，達(dá)到優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其重要性狀進(jìn)行KASP 標(biāo)記分析具有重要意義。為此，通過(guò)已知小麥性狀相關(guān)SNP 位點(diǎn)，對(duì)豫麥158 和豫麥158-42 的株高、光周期、春化、粒質(zhì)量、抗逆、品質(zhì)等相關(guān)基因進(jìn)行KASP 標(biāo)記檢測(cè)，分析豫麥158 和豫麥158-42 上述重要性狀等位基因的異同，為小麥重要性狀改良提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥材料為豫麥158及其硬質(zhì)變異系。豫麥158高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、綜合抗性較好，其品質(zhì)接近中強(qiáng)筋小麥標(biāo)準(zhǔn)；豫麥158-42為漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院超級(jí)小麥研究室于2015 年通過(guò)對(duì)豫麥158 田間選擇5 200個(gè)單穗，后經(jīng)考種選擇種植穗行圃5 000 個(gè)，2016 年經(jīng)田間調(diào)查及考種選擇112 個(gè)穗系圃種植，2017 年經(jīng)田間調(diào)查及考種選育出的硬質(zhì)變異系，該系田間長(zhǎng)相和豫麥158極其相似，但籽粒性狀有所改變。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017—2018 年在漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地進(jìn)行，豫麥158 和豫麥158-42 播種量均為300 kg/hm2，小區(qū)面積1.5 m×6 m，其他按常規(guī)大田管理。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀 苗期調(diào)查幼苗習(xí)性，成株期調(diào)查抗病性、成熟期、株高、成穗數(shù)、穗粒數(shù)，收獲后調(diào)查產(chǎn)量、千粒質(zhì)量、籽粒質(zhì)地。按照《農(nóng)作物品種區(qū)域試驗(yàn)技術(shù)規(guī)程小麥》（NY/T 1301—2007）進(jìn)行上述指標(biāo)的調(diào)查。

1.3.2 籽粒硬度及品質(zhì)指標(biāo) 采用單粒谷物特性測(cè)定儀（PertenSKCS4100）測(cè)定籽粒硬度，硬度指數(shù)小于40 為軟質(zhì)麥，大于60 為硬質(zhì)麥，居兩者中間為混合麥。

粗蛋白含量采用國(guó)標(biāo)法（GB 5009.5—2016）測(cè)定，濕面筋含量和面筋指數(shù)采用機(jī)洗法（GB/T 5506.2—2008）測(cè)定，面團(tuán)形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間及吸水率和弱化度均采用粉質(zhì)儀（GB/T 14490—2008）測(cè)定。

1.3.3 KASP 分析 KASP 分析由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所品質(zhì)育種課題組完成，該次KASP分析包括多個(gè)單位的材料，匯總后一并完成，漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院超級(jí)小麥研究室選取豫麥158及豫麥158-42 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。KASP 分析過(guò)程：選取小麥干籽粒20 粒，采用CTAB 法提取DNA。選取小麥株高、光周期、春化、品質(zhì)、粒質(zhì)量和抗逆等相關(guān)基因的61 對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為5 μL，包括2 μL DNA(10 ng/μL)、2.5 μL 2×KASP Master Mix、0.07 μL 引物（2.5 μmol/L）和0.43 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)熱15 min；95 ℃變性20 s，65 ℃退火延伸25 s，每個(gè)循環(huán)降低1 ℃，10 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s，57 ℃退火延伸60 s，30 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用Kluster Caller 軟件對(duì)Synergy H1全功能酶標(biāo)儀掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豫麥158和豫麥158-42的農(nóng)藝性狀

由表1 可知，豫麥158 與豫麥158-42 的農(nóng)藝性狀差別不大，豫麥158-42成穗數(shù)、千粒質(zhì)量、產(chǎn)量稍低；兩者籽粒性狀差別明顯，豫麥158 為混合麥，豫麥158-42為硬質(zhì)麥。

表1 豫麥158和豫麥158-42主要農(nóng)藝性狀Tab.1 Main agronomic characters of Yumai 158 and Yumai 158-42

2.2 豫麥158和豫麥158-42的加工品質(zhì)性狀

由表2可知，與豫麥158相比，豫麥158-42品質(zhì)有了較大的改善，籽粒硬度指數(shù)從43 提高到67，粗蛋白含量從13.5%提高到15.3%，濕面筋含量從29.7% 提高到35.5%，面筋指數(shù)從53.2% 提高到73.1%，弱化度從93 FU 降到了69 FU，形成時(shí)間從6.2 min 提高到10.4 min，穩(wěn)定時(shí)間從7.1 min 提高到10.9 min。

表2 豫麥158和豫麥158-42加工品質(zhì)性狀Tab.2 Processing quality characters of Yumai 158 and Yumai 158-42

2.3 豫麥158和豫麥158-42重要性狀基因的KASP標(biāo)記檢測(cè)

豫麥158 和豫麥158-42 的株高、光周期、春化、粒質(zhì)量、抗逆、品質(zhì)等相關(guān)基因的KASP 標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果如表3 所示。在推廣小麥品種中應(yīng)用的Rht（Reduced height）基因主要有Rht-B1、Rht-D1、Rht8和Rht9，Rht-B1a表現(xiàn)為高稈，Rht-B1b表現(xiàn)為矮稈；Rht-D1a表現(xiàn)為高稈，Rht-D1b表現(xiàn)為矮稈[11]。豫麥158、豫麥158-42 均含有株高主效基因Rht-B1a和Rht-D1b，豫麥158 與豫麥158-42 株高無(wú)顯著差異，田間表現(xiàn)為中等株高。小麥春化關(guān)鍵作用基因有Vrn-A1（Vernalization?A1）、Vrn-B1、Vrn-D1，分別位于5A、5B、5D染色體長(zhǎng)臂上，3個(gè)基因中任何一個(gè)為顯性時(shí)，小麥的發(fā)育特性為春性[12]。豫麥158 和豫麥158-42 中均含有2 個(gè)春化隱性基因vrn-A1、vrn-D1，缺失春化基因Vrn-B1，均含有春化基因vrn-B3CS類(lèi)型和vrn-A12147類(lèi)型以及vrn-D3Jagger類(lèi)型，兩者還同時(shí)含有春化相關(guān)微效基因TaELF3-B1（Early flowering 3-B1）Cadenza 類(lèi)型、TaELF3-D1Ria 類(lèi)型、TaTOE1-B1-1（Target of eat 1?B1?1）Cadenza 類(lèi)型和TaMOT1-D1（Molybdate transporter 1?D1）Wild 類(lèi)型，同時(shí)缺失春化相關(guān)微效基因TaFT3-B1（Flowering locus T3?B1）。另外，兩者均含有光周期基因Ppd-A1a（Photoperiod?A1a）、Ppd-B1a和Ppd-D1b，豫麥158 及豫麥158-42 田間均表現(xiàn)為半冬性。共檢測(cè)到18 個(gè)微效粒質(zhì)量基因，豫麥158和豫麥158-42 均含有14 個(gè)高粒質(zhì)量微效等位基因TaGS2-A1b（Grain size 2?A1b）、TaGS-D1a、TaGS5-A1b、TaCwi-A1a（Cell wall?bound invertase?A1a）、TaCKX-D1a（Cytokinin oxidase/dehydrogenase?D1a）、TaGW6-A1a（Grain weight 6?A1a）、TaTGW-7Aa（Thousand grain weight?7Aa）、TaSus-7A-1（Sucrose synthase?7A?1）、Hap-A、Hap-Ⅱ、Hap-6A-A、Hap-T、Hap-Ⅰ、Hap-7A-3，4 個(gè)低粒質(zhì)量微效等位基因Tabas1-B1b（Plant 2?Cys peroxiredoxin BAS1?B1b）、TPP-6AL1b（Trehalose 6?phosphate phosphatase?6AL1b）、Hap-L、TaTGW6-b。

表3 豫麥158和豫麥158-42重要性狀基因的KASP標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Detection result of important traits genes with KASP markers in Yumai 158 and Yumai 158-42

續(xù)表3 豫麥158和豫麥158-42重要性狀基因的KASP標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果Tab.3（Continued） Detection result of important agronomic traits genes with KASP Markers in Yumai 158 and Yumai 158-42

抗逆相關(guān)基因的KASP 標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示，豫麥158 和豫麥158-42 均檢測(cè)到5 個(gè)葉銹病相關(guān)基因Lr34-（Leaf rust 34?）、Lr46-、Lr37-、Lr67-、Lr68-，除葉銹病主效基因Lr67-為抗病基因外，其余均為感病基因，豫麥158 和豫麥158-42 田間均表現(xiàn)為高感葉銹病。豫麥158 和豫麥158-42 均不含有抗赤霉病主效基因Fhb1（Fusarium head blight 1）。豫麥158 和豫麥158-42 均含有抗穗發(fā)芽基因Vp1-B1c（Viviparous 1?B1c）、TaPHS_646（Pre?harvest sprouting_646）、TaPHS1-prom和感穗發(fā)芽基因TaSdr-B1b（Seed dormancy?B1b）、TaSdr-A1b。檢測(cè)到5 個(gè)抗旱微效基因，豫麥158 和豫麥158-42 均同時(shí)含有4 個(gè)抗旱微效基因1-feh-w3（Fructan 1?exohydrolase?w3）Westonia 類(lèi)型、Hap-4A-C、Hap-5D-C、TaDREB-B1a（Dehydration?responsive element binding protein?B1a）和1個(gè)不抗旱微效基因Hap-L。

籽粒品質(zhì)相關(guān)基因的KASP 標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示，豫麥158 和豫麥158-42 都含有1和5+10高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基基因，兩者品質(zhì)均較好，豫麥158 接近中強(qiáng)筋小麥標(biāo)準(zhǔn)，豫麥158-42 達(dá)到強(qiáng)筋標(biāo)準(zhǔn)。Pinb-D1、Pina-D1基因?yàn)榭刂菩←溩蚜Ｓ捕鹊闹餍Щ颍憩F(xiàn)為軟質(zhì)；Pinb2則為微效基因，表現(xiàn)為硬質(zhì)。豫麥158 同時(shí)含有Pinb-D1a、Pina-D1a、Pinb-B2a基因，而豫麥158-42 僅含有Pinb-B2a基因，缺失了小麥籽粒硬度等位基因Pinb-D1a和Pina-D1a，籽粒硬度較豫麥158 增加，而籽粒硬度與蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、吸水率呈顯著正相關(guān)關(guān)系[13]，故豫麥158-42 品質(zhì)較豫麥158提高。多酚氧化酶活性、黃色素含量會(huì)影響面粉品質(zhì)，豫麥158 及豫麥158-42 均檢測(cè)到低多酚氧化酶基因Ppo-A1b（Polyphenol oxidase?A1b）。豫麥158含有高黃色素基因TaZds-A1b（Zeta?carotene desaturase?A1b）、Psy-A1a（Phytone synthease?A1a）、TaZds-D1a和低黃色素基因Psy-D1a（Phytone synthease?D1a），豫麥158-42 含有高黃色素基因TaZds-A1b、Psy-A1a、Psy-D1g、TaZds-D1a?？梢?jiàn)兩者黃色素含量主效基因Psy-D1有所不同，豫麥158含有Psy-D1a，為低黃色素主效基因；豫麥158-42含有Psy-D1g，為高黃色素主效基因。胡瑞波等[14]研究發(fā)現(xiàn)，面粉黃色素含量與籽粒硬度呈正相關(guān)，本研究結(jié)果也間接印證了此結(jié)論。

3 結(jié)論與討論

多種分子標(biāo)記可用于小麥遺傳基礎(chǔ)分析，鄭永勝等[15]采用SSR 標(biāo)記對(duì)350 份小麥種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，把350份小麥種質(zhì)劃分為四大類(lèi)；孔子明等[16]用芯片對(duì)小麥骨干品種周麥16 進(jìn)行全基因組掃描，發(fā)現(xiàn)親本周8425B 對(duì)周麥16 的遺傳貢獻(xiàn)率遠(yuǎn)大于親本周麥9 號(hào)。本研究用KASP 技術(shù)對(duì)豫麥158 及其硬質(zhì)變異系進(jìn)行重要性狀基因分析，較SSR 方法省時(shí)省工，較基因芯片法簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、效率高。KASP 標(biāo)記檢測(cè)分析結(jié)果與田間表現(xiàn)對(duì)應(yīng)較好，用KASP 標(biāo)記檢測(cè)小麥農(nóng)藝性狀相關(guān)基因方法可行。

研究小麥某一性狀受小麥復(fù)雜遺傳背景的影響比較困難，人們?yōu)榱搜芯啃←溎骋恍誀罨蛘吣骋惶囟ɑ?，往往利用除了目?biāo)性狀不同外其他遺傳背景都相同的小麥近等基因系來(lái)研究。吳新儒等[17]用導(dǎo)入系和SSR 標(biāo)記檢測(cè)選出了22 個(gè)萊州953 的AM3 單片段代換系；張建周等[18]以銘賢169 為背景構(gòu)建了抗條銹基因Yrju4的近等基因系；孔忠新等[19]以望水白和川麥42 為背景構(gòu)建了粒質(zhì)量主效QTLQGw.nau-5A的近等基因系。本研究采用自然變異的方法選擇籽粒硬度自然變異系，基因背景單純，干擾因素少，便于開(kāi)展研究。

關(guān)于籽粒硬度基因類(lèi)型的研究比較多，丁茂予等[20]對(duì)85 份小麥品種的籽粒硬度基因進(jìn)行分析，共檢測(cè)到4 種籽粒硬度基因類(lèi)型；楊子博等[21]對(duì)74 份江蘇淮北地區(qū)和38 份黃淮麥區(qū)的小麥材料進(jìn)行KASP 標(biāo)記檢測(cè)，并對(duì)所含的籽粒硬度基因型進(jìn)行了分析，共檢測(cè)到4 種籽粒硬度基因類(lèi)型；王雪玲等[22]對(duì)66 份青海小麥品種籽粒硬度主效基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)66 份材料中硬度基因有5 種組合類(lèi)型；張福彥等[23]對(duì)109 份黃淮麥區(qū)小麥材料進(jìn)行籽粒硬度基因分析，發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的硬粒小麥中含有Pinb-D1b、Pinb-D1p和Pina-D1b3 種變異類(lèi)型。本研究所發(fā)現(xiàn)的硬質(zhì)變異系豫麥158-42 與豫麥158 大多性狀相同，只有籽粒性狀和品質(zhì)發(fā)生了變化，經(jīng)過(guò)KASP 分析，重要性狀基因組成變化不大，只有影響籽粒性狀的硬度基因和影響品質(zhì)的黃色素含量基因發(fā)生了改變，是難得的關(guān)于籽粒硬度基因的近等基因系，這為籽粒硬度研究以及分析單個(gè)硬度基因?qū)ψ蚜Ｓ捕鹊淖饔没蛘咦蚜Ｓ捕群妥蚜Ｆ焚|(zhì)關(guān)系提供了較好的材料。