李潔，易烽明，馮龍（通信作者）

1 萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院腫瘤科 （江西萍鄉(xiāng) 337000）；2 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科·江西省腫瘤臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （江西南昌 330000）

結(jié)直腸癌是一種臨床較常見的惡性腫瘤，且近年來發(fā)病率呈逐漸升高的趨勢。該病的病因及發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，尤其是分子學(xué)發(fā)病機(jī)制，但是，大多數(shù)結(jié)直腸癌仍遵循“正常黏膜-腺瘤-腺癌”的經(jīng)典發(fā)展順序。有研究證實(shí)，結(jié)直腸癌也可以其他的方式發(fā)展，如“腺瘤-癌”，且該方式主要通過Wnt/β-catenin通路激活[1]。

Hippo 信號通路起初是在果蠅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，參與細(xì)胞的增殖和凋亡，在哺乳動物中該激酶軸高度保守。此種信號通路的核心激酶是YAP/TAZ 蛋白，其可被激活的LATS1/2-Mob 復(fù)合物磷酸化，并與14-3-3蛋白相互作用且被阻斷在細(xì)胞質(zhì)中，并被泛素依賴的蛋白酶體降解，故而該信號通路可通過控制蛋白分布和蛋白酶限制YAP/TAZ 功能。而未被磷酸化的蛋白可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并與轉(zhuǎn)錄因子TEAD 結(jié)合，促進(jìn)基因表達(dá)，達(dá)到細(xì)胞增殖的目的[2]。

Hippo 信號通路已被證實(shí)參與多種癌癥（肺癌、食管癌、胃癌等）的發(fā)生、發(fā)展，主要通過調(diào)控細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)組織的生長，進(jìn)而發(fā)揮作用。在對癌癥患者進(jìn)行細(xì)胞層次的研究中均發(fā)現(xiàn)了Hippo 信號通路失衡，然而在結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制中，關(guān)于Hippo 信號通路的研究尚少。本研究旨在探討YAP1在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取2013年6月至2015年12月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的88例結(jié)直腸疾病患者作為研究對象，采集其中30例結(jié)腸腺癌患者的30份標(biāo)本作為A 組，30例直腸腺癌患者的30份標(biāo)本作為B 組，28例良性結(jié)腸息肉患者的28份標(biāo)本作為C 組。

1.2 方法

采用免疫組化ABC法檢測YAP1的表達(dá)情況，具體方法為：（1）石蠟切片，脫蠟、水化；（2）采用微波法實(shí)施抗原修復(fù)，條件為0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液；（3）取切片，滴加過氧化物酶，室溫孵育10 min，使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3次（3 min/次）；（4）除去PBS，滴加一抗/二抗，4 ℃孵育過夜/室溫孵育15 min，PBS分兩批次沖洗6次（3 min/次）；（5）除去PBS，滴加加強(qiáng)型3,3′-二氨基聯(lián)苯胺（3,3′-diaminobenzidine，DAB）（新鮮配置）顯色，反應(yīng)時間為3 min，經(jīng)蘇木精復(fù)染，封片。結(jié)果經(jīng)病理科副主任確認(rèn)。

1.3 YAP1表達(dá)強(qiáng)度

陽性細(xì)胞百分比：0分表示<5%，10分表示5%～10%，20分表示11%～30%，40分表示31%～50%，60分表示51%～75%，80分表示>75%。染色強(qiáng)度：0分表示無染色，5分表示淺棕色，10分表示棕褐色，20分表示深棕色。表達(dá)強(qiáng)度為陽性細(xì)胞百分比評分與染色強(qiáng)度評分總和。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以中位數(shù)表示（不符合正態(tài)分布），兩獨(dú)立樣本比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YAP1在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)

在結(jié)直腸腺癌組織標(biāo)本中，YAP1染色陽性表現(xiàn)為棕褐色（胞質(zhì)或胞核）；大部分腺泡均有染色，而周圍基質(zhì)細(xì)胞無陽性染色，對比度高，見圖1。

2.2 YAP1在不同類型患者組織中的表達(dá)

圖1 YAP1 在結(jié)直腸腺癌組織中的染色

YAP1在A、B 兩組中的寬大腺體細(xì)胞及周圍基質(zhì)呈寡表達(dá)，表現(xiàn)為無染色，證實(shí)YAP1具有較高的特異性；而在C 組中全部呈現(xiàn)寡表達(dá)（圖2）。正態(tài)分析結(jié)果顯示，A 組及C 組YAP1的表達(dá)數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)分布，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對比分析發(fā)現(xiàn)，A 組的YAP1表達(dá)強(qiáng)度為50分，明顯高于C組的0分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），見圖3；B 組的YAP1表達(dá)強(qiáng)度為55分，明顯高于C 組的0分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0008），見圖4。

圖2 YAP1 在不同組織中的染色

圖3 A 組與C 組的YAP1 散點(diǎn)圖

圖4 B 組與C 組的YAP1 散點(diǎn)圖

3 討論

在我國，結(jié)直腸癌每年的發(fā)病率占全部惡性腫瘤的8%～9%[3]。其發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，從細(xì)胞層次來講，以Wnt/β-catenin 為人們最為認(rèn)可的通路，但同時，也對其他通路（如Hippo 信號通路）進(jìn)行了深入的研究。Hippo 信號通路主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡來達(dá)到細(xì)胞生長平衡的目的[4]。

YAP 屬Hippo 信號通路下游的轉(zhuǎn)錄激活因子，其過表達(dá)可導(dǎo)致機(jī)體組織發(fā)生腫瘤病變，如在肝腫瘤中，可通過抑制Hippo 信號通路或過表達(dá)YAP，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。YAP 的活性變化可影響肝臟的形態(tài)及生理功能，其參與肝纖維化及肝癌的發(fā)生、發(fā)展[5]。有針對體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)的研究證實(shí)，Hippo 信號通路的破壞及隨后的YAP1的過度激活可以誘導(dǎo)浸潤性宮頸癌的發(fā)生[6]。另有研究對127例行根治性手術(shù)并接受輔助放射治療的口腔鱗癌患者的組織標(biāo)本進(jìn)行YAP1檢測，結(jié)果顯示，YAP1過表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中，通過激活胰腺泡細(xì)胞中的YAP1和TAZ，可增加JAK-STAT3的信號傳導(dǎo)，后者可導(dǎo)致小鼠胰腺腫瘤的增長[8]。有研究通過免疫組化評估了302份胃癌標(biāo)本中YAP1和P62蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常胃黏膜比較，YAP1在中分化胃腺癌、低分化腺癌和印戒細(xì)胞癌中的表達(dá)均明顯增強(qiáng)[9]。有針對YAP1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)失衡的研究顯示，利用siRNA 沉默YAP1表達(dá)可顯著抑制YAP 表達(dá)，YAP1過表達(dá)可導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[10]。一項(xiàng)納入18個研究共2 941例患者的薈萃分析表明，YAP1的過表達(dá)預(yù)示著胃腸道癌的不良預(yù)后[11]。本研究結(jié)果顯示，A、B組的YAP1表達(dá)強(qiáng)度均高于C 組，但A、B 組無明顯差異，表明YAP1的過表達(dá)與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，Hippo 信號通路失衡及YAP1過表達(dá)與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但目前越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，YAP/TAZ 存在多個步驟的級聯(lián)反應(yīng)激活，且也有眾多其他的信號通路可導(dǎo)致YAP/TAZ 的活化，使得YAP/TAZ 上游的信號網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，研究YAP/TAZ 的激活可為癌癥治療提供新的靶點(diǎn)。