廖彭瑩 吳家明 曾維錦 李務(wù)榮 廖秋麗 王淼蘭 羅 彭 潘為高

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心)，廣西 南寧 530200

酢漿草科植物感應(yīng)草Biophytumsensitivum(L.)DC.又名羞禮草、羅傘草、降落傘等，主要分布于臺(tái)灣、廣東、海南、廣西、貴州、云南等地，具有化痰定喘、消積利水的功效，用于哮喘、小兒疳積、水腫、淋濁等證[1]，壯醫(yī)記載其可“調(diào)谷道、通水道”，主治哢疳(小兒疳積)、笨浮(水腫)等[2]。在印度阿育吠陀醫(yī)療體系中，該植物用作補(bǔ)品、興奮劑、用于治療胃痛、糖尿病和哮喘等[3]?，F(xiàn)代研究表明，感應(yīng)草有多方面生理活性，包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗疲勞等[3]。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC 3.2.1.20)、α-淀粉酶和二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV)均為人體內(nèi)重要的糖代謝相關(guān)酶。α-葡萄糖苷酶位于人體小腸刷狀緣膜上皮細(xì)胞，能夠水解低聚糖釋放出葡萄糖，α-葡萄糖苷酶抑制劑可以延緩腸道內(nèi)碳水化合物的吸收，有效控制餐后血糖水平，在預(yù)防改善糖尿病大血管并發(fā)癥方面具有重要作用[4-5]。淀粉酶是分解淀粉和多糖的酶，人體內(nèi)以α-型為主[6]，α-淀粉酶抑制劑通過(guò)抑制腸道內(nèi)唾液和胰淀粉酶的活性，阻礙食物中多糖的水解和消化，減少糖分?jǐn)z取[7]。DPP-IV可以降解體內(nèi)胰高血糖素樣肽-1和葡萄糖依賴性促胰島素多肽，二者在維持血糖穩(wěn)定方面均發(fā)揮重要作用[8-9]，DPP-IV抑制劑通過(guò)增強(qiáng)二者活性，刺激胰島β細(xì)胞再生，提高糖耐量及胰島素敏感性以有效降低血糖[10]。天然植物資源是人們挖掘醫(yī)藥財(cái)富的寶庫(kù)，類型豐富的二次代謝產(chǎn)物蘊(yùn)藏著許多潛在藥用活性成分，研究人員對(duì)藥用植物提取物進(jìn)行篩選分離，已經(jīng)獲得大量能夠抑制三種糖代謝相關(guān)酶的活性組分[11-13]。研究表明，感應(yīng)草莖的乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有良好的體外抑制活性[14]，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中感應(yīng)草葉水提取物和整株水提取物、甲醇提取物則均表現(xiàn)出降糖作用[15-17]。

為了系統(tǒng)深入挖掘感應(yīng)草的藥用價(jià)值，分析其降糖作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)在已有研究基礎(chǔ)上，對(duì)感應(yīng)草的低極性組分進(jìn)行提取分析鑒定，研究其對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和DPP-IV的體外抑制效果，探討感應(yīng)草低極性組分的化學(xué)組成及對(duì)三種糖代謝相關(guān)酶的作用效果。

1 材料與方法

1.1 儀器 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent 8890/5977B)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA(上海亞榮生化儀器廠)、DHJF-2005型低溫恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)浴(武漢亨泰達(dá)儀器設(shè)備有限公司)、SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵(河南省予華儀器有限公司)、HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)、KQ-500DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Dynex Spectra MR)、721紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)、96孔板(美國(guó)True line)、微量移液器(德國(guó)Eppendoff公司)、Flex Station 3多功能酶標(biāo)儀工作站(美國(guó)Molecular Devices公司)、DPP-IV抑制活性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Cayman Chemical公司)。

1.2 材料 感應(yīng)草于2019年4月采于廣西武鳴，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)李國(guó)棟教授鑒定為酢漿草科感應(yīng)草屬植物感應(yīng)草(Biophytumsensitivum)的全株，干燥。

石油醚、無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、二甲基亞砜(DMSO)均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)(Sigma-Aldrich公司)，阿卡波糖(acarbose)(阿拉丁生化科技股份有限公司)，α-淀粉酶(α-amylase)、3,5-二硝基水楊酸(DNS)(上海麥克林生化科技有限公司)，可溶性淀粉(廣東光華科技股份有限公司)，超純水(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)。

1.3 石油醚提取物的制備 將感應(yīng)草藥材10 Kg粉碎，用200 L石油醚冷浸提取，提取2次，每次72 h，將提取液過(guò)濾，減壓濃縮，得到石油醚提取物70 g。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析條件

1.4.1 樣品處理 稱取感應(yīng)草石油醚提取物10 mg，用5 mL乙醚充分溶解，靜置，取上清液，加入適量無(wú)水硫酸鈉，靜置過(guò)夜，離心10 min，取上清液用微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣分析。

稱取感應(yīng)草石油醚提取物約200 mg，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL石油醚-正己烷(1∶1，V∶V)溶劑使之溶解，再加入0.4 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液10 mL，振蕩搖勻，40 ℃水浴加熱30 min，再加入蒸餾水20 mL，振搖，靜置分層，取上層揮干溶劑后，加乙醚溶解、過(guò)濾、濃縮，加無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，取上清液用微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣分析。

1.4.2 氣相色譜分析條件 石油醚提取物分析條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；載氣為高純氦氣；進(jìn)樣量1 μL；分流比為30∶1；程序升溫條件：柱溫100 ℃，溶劑延遲3 min，以10 ℃/min升溫至150 ℃，維持2 min，再以10 ℃/min升溫至200 ℃，維持2 min，再以6 ℃/min升溫至280 ℃，維持2 min。

石油醚提取物甲酯化產(chǎn)物分析條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；載氣為高純氦氣；進(jìn)樣量1 μL；分流比為30∶1；程序升溫條件：柱溫100 ℃，溶劑延遲3 min，以10 ℃/min升溫至150 ℃，維持2 min，再以10 ℃/min升溫至200 ℃，維持2 min，再以10 ℃/min升溫至280 ℃，維持2 min。

1.4.3 質(zhì)譜分析條件 電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，質(zhì)量范圍50～400 amu。

1.5 對(duì)三種糖代謝相關(guān)酶體外抑制活性評(píng)價(jià)

1.5.1 α-葡萄糖苷酶體外抑制活性評(píng)價(jià)[7,14]以pH 6.8濃度為0.1 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)作為反應(yīng)溶液，將樣品配成濃度為625、313、156、78、39 μg/mL的溶液。在酶標(biāo)板上設(shè)樣品反應(yīng)孔(A)、樣品對(duì)照孔(B)、空白反應(yīng)孔(C)及空白對(duì)照孔(D)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。在A、B孔中均加入50 μL樣品溶液，在C、D孔中均加入50 μLPBS緩沖液。在A、C孔中均加入50 μLα-葡萄糖苷酶溶液，在B、D孔中均加入50 μLPBS緩沖液，混合均勻后，37 ℃孵育10 min。再向每孔中加入100 μL濃度為10 mg/mL的pNPG溶液，混合均勻后，37 ℃孵育20 min，最后加入100 μL0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。在405 nm處讀取各孔吸光值(OD)。樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率(IP%)計(jì)算公式如下：

1.5.2 α-淀粉酶體外抑制活性評(píng)價(jià)[7]以pH 6.8的0.02 mol/L磷酸緩沖液(含0.006 mol/L NaCl)作為反應(yīng)溶液，將樣品配成濃度為313 μg/mL的溶液。設(shè)樣品反應(yīng)管(A)、樣品對(duì)照管(B)、空白反應(yīng)管(C)，每管設(shè)3個(gè)平行。在A、B管中均加入500 μL樣品溶液，在C管中加入500 μL緩沖液。在A、C管中均加入500 μL α-淀粉酶溶液，在B管中加入500 μL緩沖液，混合均勻后，37 ℃孵育10 min。再向每管中加入500 μL1%可溶性淀粉溶液，混合均勻后，37 ℃孵育10 min，最后加入1 mLDNS試劑，沸水浴5 min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，每管均用純水稀釋至10 mL。在540 nm處讀取各管吸光值(OD)。樣品對(duì)α-淀粉酶的抑制率(IP%)計(jì)算公式如下：

1.5.3 DPP-IV酶抑制活性評(píng)價(jià)[11]按照DPP-IV酶抑制活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書開展活性測(cè)試，以pH 7.5的50 mM Tris緩沖液為反應(yīng)溶液，將樣品配成濃度為50 μg/mL溶液。在酶標(biāo)板上設(shè)全酶孔(A)、空白孔(B)及樣品孔(C)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。在A孔中依次加入100 μL緩沖液，50 μLDPP-IV酶和50 μL H-Gly-Pro-AMC溶液，在B孔中依次加入150 μL緩沖液，50 μL H-Gly-Pro-AMC溶液，在C孔中依次加入50 μL樣品溶液、50 μL緩沖液、50 μLDPP-IV酶和50 μL H-Gly-Pro-AMC溶液。加樣結(jié)束后，37 ℃孵育30 min。在激發(fā)光波長(zhǎng)350～360 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)450～465 nm處讀取熒光值(F)。樣品對(duì)DPP-IV酶的抑制率(IP%)計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果 對(duì)感應(yīng)草石油醚提取物及其甲酯化產(chǎn)物的GC-MS總離子流圖中的各峰進(jìn)行質(zhì)譜掃描，經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索NIST05a、Wiley275標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)，采用峰面積歸一化法計(jì)算出各成分的相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表1和2，從石油醚提取物中鑒定出7個(gè)化學(xué)成分，占流出峰總面積的37.95%，其中相對(duì)含量最高的成分是棕櫚酸乙酯(15.57%)和硬脂酸乙酯(6.39%)，化學(xué)成分類型主要是脂肪族類(36.55%)、芳香族類(1.40%)。從石油醚提取物甲酯化產(chǎn)物中鑒定出6個(gè)化學(xué)成分，占流出峰總面積的39.13%，其中相對(duì)含量最高的成分是棕櫚酸甲酯(14.99%)和二十四酸甲酯(6.87%)，化學(xué)成分類型主要是脂肪族類(36.69%)、芳香族類(2.44%)

表1 感應(yīng)草石油醚提取物的GC-MS分析結(jié)果

表2 感應(yīng)草石油醚提取物甲酯化產(chǎn)物的GC-MS分析結(jié)果

2.2 對(duì)三種糖代謝相關(guān)酶體外抑制活性評(píng)價(jià)結(jié)果 感應(yīng)草石油醚提取物對(duì)三種糖代謝相關(guān)酶的體外抑制活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3、4和5，從中可以看出，石油醚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用較好，在本測(cè)定條件下，其抑制效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖；在625～39 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，石油醚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨樣品濃度上升而提高，呈劑量依賴性，其IC50值為81 μg/mL，低于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的IC50值393 μg/mL。但石油醚提取物對(duì)α-淀粉酶和DPP-IV酶的抑制活性較差，在同等質(zhì)量濃度下，其抑制效果均低于陽(yáng)性對(duì)照。

表3 感應(yīng)草石油醚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率

表4 感應(yīng)草石油醚提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制率

表5 感應(yīng)草石油醚提取物對(duì)DPP-IV酶的抑制率

3 結(jié)論

從感應(yīng)草石油醚提取物及其甲酯化產(chǎn)物中各檢出7個(gè)和6個(gè)化學(xué)成分，這些成分均為首次從該植物中檢出，化學(xué)成分類型主要是脂肪族類，包括多種脂肪酸及其酯，分別為棕櫚酸乙酯、棕櫚酸、亞油酸乙酯、硬脂酸乙酯、9,15-十八碳二烯酸、硬脂酸、二十四酸(相對(duì)含量均大于5%)，同時(shí)均檢出芳香族類成分2,5-二叔丁基酚(相對(duì)含量均大于1%)。Jirovetz L.等[18]曾對(duì)產(chǎn)于印度的感應(yīng)草所含揮發(fā)油組分進(jìn)行分析，從中鑒定了69個(gè)成分，所得成分以芳香族和萜類成分為主，脂肪族類成分占少數(shù)。石油醚提取物和揮發(fā)油組分均屬于低極性組分，但由于提取方法的差異，所得組分的化學(xué)組成一般有較大差異，石油醚冷浸提取溫度低，所得組分以醇、酸、酯類為主，水蒸氣蒸餾法所得揮發(fā)油中酮、醛、萜、烷烴、烯烴類低沸點(diǎn)組分較多[19]。另外，同一品種植物的成分及含量會(huì)隨著季節(jié)不同及生長(zhǎng)環(huán)境變化而波動(dòng)，因此不同產(chǎn)地和不同采收季節(jié)的藥材化學(xué)組成有差異[20]。感應(yīng)草低極性組分的化學(xué)組成與產(chǎn)地和時(shí)間的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

活性測(cè)定結(jié)果表明，感應(yīng)草石油醚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶體外抑制活性較好，在本測(cè)定條件下，其抑制效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖。Liu B等報(bào)道海草中的油酸、亞油酸、二十碳五烯酸、α-亞麻酸、花生四烯酸和棕櫚酸均對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用[21]。感應(yīng)草石油醚提取物中檢出的成分主要是脂肪族類，其中的脂肪酸類應(yīng)為抑制α-葡萄糖苷酶的主要成分。

本研究表明，感應(yīng)草石油醚提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制效果優(yōu)于阿卡波糖，其中發(fā)揮抑制作用的功能成分包括脂肪酸及其酯類，進(jìn)一步證實(shí)了感應(yīng)草是開發(fā)α-葡萄糖苷酶抑制劑的良好天然植物資源。感應(yīng)草的化學(xué)組成仍有待進(jìn)一步分析，特別是對(duì)不同產(chǎn)地不同時(shí)間采集的感應(yīng)草的化學(xué)成分和生理活性的差異性關(guān)注較少。本課題組將對(duì)其展開更深入的分離分析，挖掘其中能夠抑制糖代謝相關(guān)酶的活性組分和單體，加深對(duì)該植物資源的系統(tǒng)研究。