黃松殿 俞建妹 龍敏 劉芳 沈遐

摘 要：采用5%濃度的洗潔精對(duì)異葉南洋杉莖段預(yù)處理后污染率為80.00%。選用添加PVP藥品0.05g的5%次氯酸鈉溶液消毒滅菌時(shí)間12min，污染率為53.33%，但對(duì)莖段有一定的損傷作用。始芽誘導(dǎo)最佳時(shí)間為春末夏初，從母株基部采取健壯芽，保留鉆形葉接種后分化不定芽時(shí)間為26d，始芽生長(zhǎng)健康。

關(guān)鍵詞：異葉南洋杉;外植體;預(yù)處理;消毒滅菌

中圖分類(lèi)號(hào)：S722.3+7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20201115025

收稿日期：2020-10-10

基金項(xiàng)目：南寧良鳳江國(guó)家森林公園“南寧樹(shù)木園優(yōu)質(zhì)用材樹(shù)種科研項(xiàng)目培育與深化”（項(xiàng)目編號(hào)：ky2018001）

作者簡(jiǎn)介：黃松殿（1966-），男，本科，高級(jí)工程師。研究方向：森林培育、植物栽培、植物分類(lèi)學(xué)。

異葉南洋杉（學(xué)名：Araucaria heterophylla（Salisb.）Franco）是南洋杉科南洋杉屬植物，喬木，在原產(chǎn)地高可達(dá)50m以上[1]。異葉南洋杉樹(shù)干通直，樹(shù)皮暗灰色，樹(shù)冠塔形，樹(shù)姿優(yōu)美，我國(guó)廣東、福建、廣西等地均有引種栽培，是南方園林綠化的優(yōu)良樹(shù)種，也是世界著名的公園綠化樹(shù)種。其木材紋理美觀，是木質(zhì)家具貼面的優(yōu)良用材樹(shù)種。異葉南洋杉種子結(jié)實(shí)率較低，南寧樹(shù)木園于20世紀(jì)80年代初引種的數(shù)十棵異葉南洋杉苗木至今仍未見(jiàn)結(jié)實(shí)現(xiàn)象。關(guān)于異葉南洋杉育苗方面的報(bào)道甚少，迄今只查到危孝棋團(tuán)隊(duì)于1989—2004年報(bào)道關(guān)于異葉南洋杉根接、萌條扦插及根插繁殖技術(shù)研究的3篇文章[2-4]，及彭東輝等申請(qǐng)的專(zhuān)利“一種異葉南洋杉水培根誘導(dǎo)與培養(yǎng)技術(shù)”[5]，并未見(jiàn)組培方面的報(bào)道。異葉南洋杉不定芽小枝的葉排列密集，開(kāi)展，鉆形，光綠色，向上彎曲，通常兩側(cè)扁，具3～4棱，上面具多數(shù)氣孔線，易附著微生物，清理難度大，不易獲得無(wú)菌體。為此，南寧樹(shù)木園于2018年開(kāi)始立項(xiàng)進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，力爭(zhēng)篩選出異葉南洋杉組織培養(yǎng)適宜的外植體類(lèi)型，取材時(shí)間及其消毒方法，為之后的無(wú)性繁殖提供技術(shù)支持，為以后規(guī)?；嘤齼?yōu)質(zhì)苗木應(yīng)用于市場(chǎng)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

試驗(yàn)材料來(lái)源于良鳳江國(guó)家森林公園（南寧樹(shù)木園）。以三十二年生，胸徑30.0～33.9cm，樹(shù)高22.6～25.0m，枝下高5.6～8.8m，樹(shù)干通直、寶塔式樹(shù)冠的優(yōu)良單株基部萌芽、樹(shù)干不定芽為外植體。試驗(yàn)時(shí)間為2018年8月—2020年9月。

1.2?方法

1.2.1?外植體的預(yù)處理對(duì)外植體消毒效果的影響

將采回的外植體修剪成4～6cm，在流水中沖洗5～8min后用干凈的棉花擦拭莖段及鉆形葉除去表皮上的灰塵和雜物等，選用洗潔精、洗衣粉、多菌靈5%濃度的溶劑分別浸泡15min，再用流水沖洗30min，后用蒸餾水沖洗6次，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，備用。消毒劑選用0.1%升汞消毒6min，待消毒處理后的外植體均接到始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)污染率。

1.2.2?不同消毒劑組合對(duì)外植體消毒效果的影響

將外植體按1.2.1方法預(yù)處理后，分別放入不同消毒劑中進(jìn)行處理，消毒劑組合有：先用75%酒精浸泡20～30s，后將外植體用0.1%升汞消毒（①）;先用75%酒精浸泡20～30s，后將外植體用0.1%升汞消毒，滴入3mL吐溫80（②）;先用75%酒精浸泡20～30s，后將外植體用0.1%升汞消毒，添加PVP藥品0.05g（③）;5%次氯酸鈉溶液，滴入600青霉素（④）;5%次氯酸鈉溶液，滴入3mL吐溫80（⑤）;5%次氯酸鈉溶液，添加PVP藥品0.05g（⑥）。

①②③處理的消毒時(shí)間分別為3min、6min和9min，④⑤⑥處理的消毒時(shí)間分別為8min、10min和12min，不間斷攪拌后再用無(wú)菌水沖洗4～6次，每個(gè)處理接種30個(gè)，3次重復(fù)。3～60d后統(tǒng)計(jì)污染率及枯死率。

1.2.3?不同外植體取材部位消毒效果的影響

依據(jù)植物生長(zhǎng)特性，供體植株的外植體取材部位的不同可導(dǎo)致外植體生理狀態(tài)上的差異[6]。有研究表明，同一器官的不同部位取下的相同類(lèi)型組織，其再生能力也不同[7]。本試驗(yàn)外植體采集分為伐木樹(shù)樁萌芽、完整木基部促芽萌芽及樹(shù)干節(jié)間處促芽萌芽，莖段在進(jìn)行預(yù)處理及消毒處理后接入始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種30個(gè)，3次重復(fù)。3d后觀察，統(tǒng)計(jì)污染率與萌芽時(shí)間。

1.2.4?不同外植體取材季節(jié)對(duì)消毒效果的影響

在春季3月、夏季4—6月、秋季7—9月及冬季10—11月連續(xù)取材，分別取伐木樹(shù)樁萌芽、完整木基部促芽萌芽及樹(shù)干結(jié)節(jié)處促芽萌芽。進(jìn)行取材季節(jié)對(duì)外植體萌芽率的影響的比較。每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，3次重復(fù)。3d后觀察，統(tǒng)計(jì)污染率與萌芽率。

1.2.5?去留外植體鉆形葉對(duì)消毒效果的影響

莖段在進(jìn)行預(yù)處理及消毒處理后分為保留鉆形葉及去除鉆形葉2種外植體，分別接入始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中觀察其感菌及褐化情況。每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，3次重復(fù)。3d后觀察，統(tǒng)計(jì)污染率及褐化率。

1.3?培養(yǎng)條件

初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS加6-BA2.0～5.0mg·L-1加IAA1.0～3.0mg·L-1加CH250mg·L-1，白糖30g·L-1，瓊脂5g·L-1，pH6.0。培養(yǎng)基在1.1MP，121℃高溫高壓條件下滅菌消毒15min。培養(yǎng)室溫度26±2℃，光照時(shí)間12～14h·d-1，光照強(qiáng)度800～2000lx。新轉(zhuǎn)接的培養(yǎng)物，在800lx光照條件下培養(yǎng)7～10d。

1.4?數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2017、SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及顯著性分析，統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率、萌芽率。

2?結(jié)果與分析

2.1?預(yù)處理對(duì)外植體消毒滅菌效果的影響

從圖1可知，采用洗潔精、洗衣粉為預(yù)處理劑對(duì)異葉南洋杉莖段處理后，莖段在前3d開(kāi)始出現(xiàn)污染現(xiàn)象，說(shuō)明其表面菌類(lèi)未得到較好清理，在30d內(nèi)污染情況持續(xù)上升趨向穩(wěn)定，在30～60d仍然有部分莖段存在污染現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為內(nèi)源菌污染;采用多菌靈預(yù)處理劑處理后的莖段，表面污染開(kāi)始時(shí)間在3d后，且在30d內(nèi)污染率相對(duì)低，可能原因?yàn)槎嗑`對(duì)莖段表面菌類(lèi)具有相對(duì)較好的殺菌效果，但其對(duì)莖段內(nèi)源菌的消毒效果相對(duì)較差，在30～60d期間內(nèi)源菌污染率近40.00%，總污染率達(dá)90.00%。綜上所述，洗潔精對(duì)莖段的預(yù)處理效果相對(duì)較好，接種后60d污染率控制在80.00%。

2.2?不同消毒劑組合對(duì)外植體消毒效果的影響

從表1可知，5%次氯酸鈉溶液對(duì)異葉南洋杉莖段消毒效果相對(duì)較好，污染率低于64.00%，但其對(duì)莖段的損傷力較大，莖段枯死率在15.00%以上;為了能較好地降低污染率及枯死率，在消毒劑溶液中添加吐溫80或PVP，一定程度能起到助力消毒及抑制污染的效果;PVP的抑制污染效果相對(duì)較好，而在5%次氯酸鈉溶液中添加600青霉素對(duì)消毒作用也起到一定的改善作用。

2.3?不同外植體取材部位對(duì)消毒及萌芽的影響

從表2可知，完整木樹(shù)干節(jié)間萌芽污染率相對(duì)較低，伐樁萌芽其次，完整木基部萌芽最高，這與植株所處環(huán)境相關(guān)，取材地位于森林景區(qū)，菌類(lèi)繁多，越接近地面，菌種越繁雜，去除外植體表面菌類(lèi)難度越大。伐樁萌芽莖段因集聚樹(shù)兜及根系的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，粗壯，始芽分化時(shí)間快，在第26天開(kāi)始分化成可視芽，芽尖圓潤(rùn)飽滿(mǎn)，健康;完整木基部萌芽莖段開(kāi)始分化成可視芽時(shí)間為第45天，芽尖飽滿(mǎn);完整木樹(shù)干節(jié)間萌芽莖段開(kāi)始分化成可視芽時(shí)間為第62天，芽尖纖細(xì)，偏淡黃。從莖段的始芽分化情況可知，其分化出的新芽跟其莖段內(nèi)含養(yǎng)分有關(guān)，芽分化時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，原莖段基部形成愈傷時(shí)間長(zhǎng)不能從培養(yǎng)基中吸取養(yǎng)分，如其體內(nèi)的養(yǎng)分含量不足易導(dǎo)致不定芽難以分化，抽長(zhǎng)生長(zhǎng)，莖段易褐化枯死。因此，從母株基部采取健壯芽為外植體利于不定芽分化及抽長(zhǎng)生長(zhǎng)。

2.4?不同外植體取材季節(jié)對(duì)消毒效果的影響

從圖2可知，在四季中采集外植體的時(shí)間對(duì)消毒及不定芽萌芽影響較大，根據(jù)自然界的菌類(lèi)繁衍規(guī)律及植株的生物學(xué)特性，植株不同時(shí)節(jié)的抽芽生長(zhǎng)結(jié)實(shí)均需遵循物候期。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果可知，異葉南洋杉進(jìn)行消毒建立無(wú)菌體系的最佳時(shí)節(jié)為春末夏初，外植體生長(zhǎng)點(diǎn)集聚的養(yǎng)分多，分化能力強(qiáng)，利于形成健康的不定芽。秋冬季分化的少量不定芽長(zhǎng)勢(shì)弱，難以自養(yǎng)，易褐化，難以形成健壯芽苗。

2.5?去留外植體鉆形葉對(duì)消毒效果的影響

從試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)可知，保留外植體鉆形葉的污染率為70.00%，褐化率為13.33%;去除外植體鉆形葉的污染率為46.67%，褐化率為100.00%。異葉南洋杉嫩枝鉆形葉排列密集，保留時(shí)難以清理葉腋菌類(lèi)個(gè)體，去除后由于莖段傷口過(guò)多既不利于消毒劑處理也不利于接種后傷口愈合，易導(dǎo)致褐化枯死。因此，在進(jìn)行外植體消毒過(guò)程中最好是保留鉆形葉。

3?結(jié)論與討論

異葉南洋杉鉆形葉密集，葉腋處易積菌難以清除，用軟毛刷除塵易傷皮，莖段易褐化枯死;用流水沖洗或棉布清洗不易清除邊角灰塵，滋生真菌、細(xì)菌，不易獲得無(wú)菌體。在試驗(yàn)中采用5%濃度的洗潔精對(duì)異葉南洋杉莖段的預(yù)處理效果相對(duì)較好，接種后60d污染率控制在80.00%;在消毒過(guò)程中選擇5%次氯酸鈉溶液及添加PVP藥品0.05g的消毒劑消毒時(shí)間12min，污染率可控制在53.33%內(nèi)，但對(duì)莖段有一定損傷作用。從母株基部采取健壯芽開(kāi)始分化不定芽時(shí)間為第26天，始芽生長(zhǎng)健康;始芽誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，通常需60d才發(fā)生始芽分化，而莖段保鮮時(shí)間通常在26～62d逐漸出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，難以維持到不定芽分化生長(zhǎng)階段。從目前情況來(lái)看，為了能獲得較多可應(yīng)用的外植體，需加大消毒數(shù)量，通過(guò)增加消毒基數(shù)，或在林區(qū)時(shí)先進(jìn)行不定芽消毒處理后再進(jìn)行采集，以獲得更多可用芽。

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（責(zé)任編輯?李媛媛）