朱琨瑩, 郭世杰, 袁若森, 潘 東, 張 春, 陳曉旭, 衣延明, 楊 陽(yáng), 鄭柏松, 姜春來(lái)

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院艾滋病與病毒研究所，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院新生兒科，吉林 長(zhǎng)春130021；3.長(zhǎng)春百克生物科技股份公司，吉林 長(zhǎng)春 130012；4.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物免疫系，吉林 長(zhǎng)春 130012）

水痘－ 帶狀皰疹病毒（varicella zoster virus，VZV） 屬皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科，以人類(lèi)為其唯一自然宿主且具有嗜神經(jīng)性［1-3］。水痘多好發(fā)于兒童，初次感染會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱和皮疹等癥狀，病愈后少量病毒會(huì)終身潛伏于宿主感覺(jué)神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)細(xì)胞中［4-6］。若宿主高齡或機(jī)體免疫力降低時(shí)，潛伏的病毒會(huì)被再次激活并大量增殖，對(duì)皮膚細(xì)胞和局部神經(jīng)產(chǎn)生損傷，從而形成帶狀皰疹［7］。帶狀皰疹的患病率和嚴(yán)重程度隨著年齡增加而升高，尤其50 歲后明顯升高［8-10］，可反復(fù)發(fā)作，愈后神經(jīng)痛可持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年，嚴(yán)重影響患者的身心健康。目前，對(duì)于水痘和帶狀皰疹的治療尚無(wú)特效方法，接種疫苗是唯一有效且可靠的預(yù)防控制手段。

我國(guó)現(xiàn)行用于預(yù)防水痘和帶狀皰疹疾病的疫苗中主要成分多為水痘減毒活病毒OKA 株［11］。在疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中，病毒滴度作為其主要質(zhì)控項(xiàng)目，需要在多個(gè)步驟中進(jìn)行多次檢測(cè)。經(jīng)典的VZV 滴度檢測(cè)方法（藥典方法） 為蝕斑法［12］，該方法包括培養(yǎng)細(xì)胞、感染病毒、染色、計(jì)數(shù)和判定等步驟，檢測(cè)周期至少7 d （不包括染毒前細(xì)胞傳代的時(shí)間），因此在某些需要根據(jù)病毒滴度結(jié)果進(jìn)行下一步驟操作的生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，該方法會(huì)成為研發(fā)與生產(chǎn)的限速環(huán)節(jié)。同時(shí)，該方法需要檢測(cè)人員具有較強(qiáng)的無(wú)菌操作技術(shù)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，來(lái)完成細(xì)胞建庫(kù)、復(fù)蘇和傳代等步驟及斑塊的人工計(jì)數(shù)；且檢測(cè)細(xì)胞均為人二倍體細(xì)胞，在細(xì)胞庫(kù)建立和維護(hù)方面花費(fèi)的成本較大。有研究［13］采用PCR 法擴(kuò)增病毒以快速檢測(cè)VZV 病毒滴度，可將檢測(cè)時(shí)間縮短至24 h （感染病毒后），且該方法與蝕斑法檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，但要根據(jù)VZV 病毒基因設(shè)計(jì)引物和探針，試驗(yàn)過(guò)程需要PCR 法與熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)檢測(cè)設(shè)備的要求較高。因此，開(kāi)發(fā)一種能快速、準(zhǔn)確、低成本、且對(duì)人員操作經(jīng)驗(yàn)要求低的檢測(cè)病毒滴度的方法，對(duì)蝕斑法進(jìn)行替代，作為疫苗研發(fā)與生產(chǎn)過(guò)程中的檢測(cè)方法，可大大加快研究進(jìn)程，縮短生產(chǎn)過(guò)程中的檢測(cè)時(shí)間。

VZV 表面的糖蛋白至少有8 種，集中存在于病毒的囊膜和感染細(xì)胞的胞膜中，與病毒的致病性與免疫原性有密切關(guān)系［14］。有報(bào)道［15-16］針對(duì)VZV 表面糖蛋白進(jìn)行ELISA 雙抗體夾心定量方法的開(kāi)發(fā)，但該方法中應(yīng)用的單克隆抗體為雜交瘤所產(chǎn)生，且酶標(biāo)抗體為IgG2a 類(lèi)型，抗體的批間差異較大，不易質(zhì)控，從而導(dǎo)致方法穩(wěn)定性差。本研究以IgG1類(lèi)型的針對(duì)空間構(gòu)象表位的基因工程單抗為基礎(chǔ)，針對(duì)抗原性最強(qiáng)的IgE 糖蛋白進(jìn)行研究，建立更穩(wěn)定、 更準(zhǔn)確的ELISA 雙抗體夾心定量檢測(cè)方法，為疫苗的研發(fā)和質(zhì)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1疫苗、病毒和參考品

水痘減毒活疫苗（Var）、水痘減毒活疫苗參考品、百白破疫苗（DPT）、狂犬疫苗（PM 株） 和流感減毒活疫苗由長(zhǎng)春百克生物制品有限公司提供，流感裂解滅活疫苗為長(zhǎng)春生物制品所有限責(zé)任公司產(chǎn)品，狂犬疫苗（aG 株） 為寧波榮安生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，HPV-18 型純化液由吉林大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2主要試劑和儀器

抗VZV 糖蛋白的基因工程抗體VZV-mAb-01、VZV-mAb-02、 VZV-mAb-03、 VZV-mAb-04、VZV-mAb-05、 VZV-mAb-HRP-01、 VZV-mAb-HRP-02 和VZV-mAb-HRP-03 由長(zhǎng)春百克生物科技股份公司提供， 人血清白蛋白（human serum albumin， HSA） 購(gòu)自?shī)W地利國(guó)奧克特琺瑪公司，牛血清購(gòu)自北京希凱創(chuàng)新科技有限公司，脫脂奶粉購(gòu)自蒙牛乳業(yè)， 牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA） 購(gòu)自新西蘭Proliant New Zealand公司，精氨酸購(gòu)自上海協(xié)和氨基酸有限公司，谷氨酸鈉購(gòu)自湖南新綠方藥業(yè)有限公司，尿素購(gòu)自湖南芙蓉制藥有限公司，氯化鈉購(gòu)自河北華晨藥業(yè)有限公司，海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和甘氨酸購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。全自動(dòng)酶標(biāo)儀（iMark） 和微孔板洗板機(jī)（1575） 購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公 司， CO2培 養(yǎng) 箱（311） 購(gòu) 自 美 國(guó)Thermo 公 司， 電 子 天 平（A1104） 購(gòu) 自 美 國(guó)Mettler Toledo 公司。

1.3檢測(cè)方法的建立

1.3.1 篩選捕獲抗體和酶標(biāo)抗體組合 根據(jù)說(shuō)明書(shū)所提供的濃度， 將5 種捕獲抗體（VZV-mAb-01、 VZV-mAb-02、 VZV-mAb-03、 VZV-mAb-04和VZV-mAb-05） 分 別 稀 釋 至1 mg·L－1， 每 孔100 μL 包被 酶標(biāo)板； 抗 原為100 倍稀釋的VZV，加入陽(yáng)性孔中， 對(duì)應(yīng)的陰性孔加入1%BSA ［含1% BSA 的0.5% 磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST），pH 值為7.4±0.1］ 溶液；將3 種酶標(biāo)抗體（VZVmAb-HRP-01、 VZV-mAb-HRP-02 和VZV-mAb-HRP-03） 分別稀釋至0.1 g·L－1，將每種酶標(biāo)抗體稀釋為低、中和高濃度，分別加入不同捕獲抗體包被的酶標(biāo)板中，以確保每種捕獲抗體與每種酶標(biāo)抗體均進(jìn)行交叉實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)450 nm 處捕獲抗體與酶標(biāo)抗體的陽(yáng)性樣品（VZV） 與陰性樣品（1%BSA） 的吸光度（A） 值，其比值即陽(yáng)性值／陰性值（positive value/negative value， P/N）， P/N 比值越大， 對(duì)應(yīng)的捕獲抗體與酶標(biāo)抗體的組合越優(yōu)［17-18］。

1.3.2 捕獲抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇 將“1.3.1” 步驟中篩選出來(lái)最優(yōu)包被抗體與酶標(biāo)抗體組合用棋盤(pán)滴定法進(jìn)行最適濃度的篩選。將捕獲抗體以1∶2 500（900 μg·L－1）、1∶5 000（450 μg·L－1）、1∶7 500 （338 μg·L－1） 和1∶10 000（225 μg·L－1） 進(jìn)行包被，酶標(biāo)抗體分別以1∶2 000 （0.28 μg·L－1）、1∶4 000（0.14 μg·L－1）、1∶6 000 （0.09 μg·L－1）、1∶8 000 （0.07 μg·L－1） 和1∶10 000 （0.05 μg·L－1）進(jìn)行交叉實(shí)驗(yàn)，以P/N 比值最大值所對(duì)應(yīng)的濃度作為包被抗體和酶標(biāo)抗體的最適工作濃度。

1.3.3 包被條件的選擇 包被液的選擇：分別以0.05 mol·L－1CBS 緩沖液（pH 9.6）、0.05 mol·L－1PBS 緩沖液（pH 7.4）、0.05 mol·L－1Tris-HCl 緩沖液（pH 6.6） 和0.05 mol·L－1Tris-HCl 緩沖液（pH 8.8） 為包被抗體稀釋液，稀釋相同濃度的包被抗體進(jìn)行酶標(biāo)板包被，以P/N 比值最大值所對(duì)應(yīng)的該種包被稀釋液為最適包被液。包被溫度和時(shí)間的選擇：以最適包被液包被酶標(biāo)板， 分別置于4℃過(guò)夜，采用37 ℃、1 h，37 ℃、2 h 和37 ℃、3 h 條件進(jìn)行包被，其他步驟均相同，檢測(cè)450 nm處A 值，綜合A 值和P/N 比值，選擇2 個(gè)數(shù)據(jù)均較大的包被條件為最適包被條件［19］。

1.3.4 封閉條件的選擇 分別以 1%BSA、3%BSA （含3% BSA 的0.5% PBST 緩 沖 液，pH 值為7.4±0.1）、5% 脫脂奶粉和10% 新生牛血清作為封閉劑，其他步驟均相同，綜合P/N 比值最大值和檢測(cè)值的范圍確定最適封閉劑。對(duì)比不同封閉條件（37 ℃、1 h 和37 ℃、2 h） 下的檢測(cè)值，確定最適封閉條件。

1.3.5 夾心抗原和酶標(biāo)抗體反應(yīng)條件的選擇 樣品稀釋液的選擇：分別以1%BSA、0.5%PBST （含0.5% 吐 溫-20 的PBS 緩 沖 液，pH 值 為7.4±0.1）和PBS 緩沖液（pH 值為7.4±0.1） 為樣品稀釋液，稀釋VZV 與酶標(biāo)抗體，以P/N 比值最大值所對(duì)應(yīng)的該種稀釋液為最適樣品稀釋液。

夾心抗原與酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間的確定：采用最適包被液稀釋包被抗體至最適濃度后，稀釋相同濃度的夾心抗原，保證后續(xù)步驟中酶標(biāo)抗體37 ℃、1 h 反應(yīng)條件下，夾心抗原37 ℃分別作用30、45、60、75 和90 min，采用ELISA 法檢測(cè)A （450） 值并計(jì)算P/N 比值，以確定夾心抗原的最適反應(yīng)時(shí)間；夾心抗原于37℃、1 h 反應(yīng)條件下，酶標(biāo)抗體于37℃條件下分別作用30、45、60、75 和90 min，采用ELISA 法檢測(cè)A （450） 值并計(jì)算P/N 比值，以確定酶標(biāo)抗體最適反應(yīng)時(shí)間。

1.3.6 顯色條件的選擇 顯色溫度為37℃時(shí)，采用TMB 終 點(diǎn) 法 測(cè) 定 顯 色5 、 10 、 15 、 20 、 25 和30 min 時(shí)的A （450） 值，并計(jì)算P/N 比值。綜合P/N 比值與陰性對(duì)照的A （450） 值，選擇P/N 比值較大且陰性對(duì)照A （450） 值較小的顯色時(shí)間為最適顯色時(shí)間。

1.4檢測(cè)方法的驗(yàn)證

1.4.1 特異性驗(yàn)證 采用建立的雙抗體夾心法以相同的樣品稀釋倍數(shù)（10、30、90 和270 倍） 檢測(cè)Var、 凍干人用狂犬病疫苗aG 株與PM 株（RabaG、 Rab-PM）、 凍干流感減毒活疫苗（LAIV）、流感裂解滅活疫苗（TIV）、DPT 和HPV-18 型病毒純化液（HPV-18）；市售多家水痘減毒活疫苗中輔料成分： HSA、海藻糖、谷氨酸鈉、蔗糖、葡萄糖、尿素、精氨酸、甘氨酸、甘露醇和氯化鈉，以驗(yàn)證方法的特異性［20-21］。

1.4.2 線性驗(yàn)證 將Var 參考品進(jìn)行2 倍系列稀釋?zhuān)罡呦♂屩?6 384 倍，采用建立的雙抗體夾心方法進(jìn)行檢測(cè)［20］。以病毒滴度對(duì)A （450） 值進(jìn)行直線回歸分析，選取至少連續(xù)6 點(diǎn)對(duì)應(yīng)曲線的R2＞0.95為線性范圍。后對(duì)線性范圍內(nèi)至少6 個(gè)濃度在不同時(shí)間進(jìn)行6 個(gè)獨(dú)立批次的校準(zhǔn)曲線的線性驗(yàn)證。

1.4.3 準(zhǔn)確性和精密性驗(yàn)證 批內(nèi)回收率與精密度：包被同一批酶標(biāo)板，將3 份參考品分別稀釋為506 （定量下限）、1 013 （低濃度）、1 520 （中濃度）、2 027 （高濃度） 和2 534 PFU·mL－1（定量上限），每份參考品的每個(gè)稀釋度進(jìn)行4 次重復(fù)檢測(cè)，同時(shí)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程計(jì)算樣品的病毒滴度，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV） 及回收率［20］。批間回收率與精密度：將參考品分為3 塊板、3 d 分別稀釋為上述濃度，每個(gè)稀釋度進(jìn)行8 次重復(fù)檢測(cè)，同時(shí)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程回算樣品的病毒滴度，計(jì)算CV 和回收率。

2 結(jié) 果

2.1檢測(cè)方法的優(yōu)化

2.1.1 捕獲抗體和酶標(biāo)抗體最優(yōu)組合 捕獲抗體VZV-mAb-03 和酶標(biāo)抗體VZV-mAb-HRP-02 的組合P/N 比值為5.9，遠(yuǎn)高于其他組合（1.0～2.6），故選用該組合為最優(yōu)組合，并繼續(xù)進(jìn)行方法的優(yōu)化和驗(yàn)證。捕獲抗體和酶標(biāo)抗體的篩選P/N 比值結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 捕獲抗體和酶標(biāo)抗體組合篩選P/N 比值Tab.1 P/N ratios screened by combination of capture antibodies and enzyme-labeled antibodies

2.1.2 捕獲抗體和酶標(biāo)抗體的最適工作濃度VZV-mAb-03 和VZV-mAb-HRP-02 組合棋盤(pán)滴定法確定的A （450） 值見(jiàn)表2，根據(jù)結(jié)果可確定捕獲抗體VZV-mAb-03 的最適濃度范 圍 為1 ∶2 500～1 ∶7 500，酶標(biāo)抗體VZV-mAb-HRP-02 的最適濃度范圍為1∶4 000～1∶8 000，二者的稀釋倍數(shù)的乘積為2 000 ～3 000 萬(wàn)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，取VZVmAb-03 和VZV-mAb-HRP-02 的 稀 釋 度 均 以1∶5 000 為最適濃度。

2.1.3 最適包被條件 在3 種VZV 濃度條件下，Tris-HCl （pH 值為8.7±0.1） 作為包被液的P/N比值均最大， 包被效果最好， 因此選擇Tris-HCl（pH 值為8.7±0.1） 為最適包被液。4 種包被液包被效果的P/N 值見(jiàn)圖1。

4 種包被條件的陰性A （450） 值相差很小，陽(yáng)性A （450） 值與P/N 比值呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，4 ℃過(guò)夜包被的P/N 比值最大，確定最適包被條件為4 ℃過(guò)夜（18 h）。包被溫度和時(shí)間的A （450） 值及P/N 值見(jiàn)表3。

2.1.4 最適封閉條件 不同種類(lèi)封閉液和相同濃度VZV 條件下，封閉2 h 時(shí)陽(yáng)性A （450） 值約為封閉1 h 時(shí)的1.2～1.6 倍，差別較大；而封閉2 h 時(shí)陰性A （450） 約為封閉1 h 的0.8～1.1 倍，差別較小， 可 確 定 最 適 封 閉 條 件 為37 ℃、 2 h。 以1%BSA 為封閉劑時(shí)P/N 比值最大，為10.32，因此選擇1%BSA 為最適封閉劑。封閉條件和封閉液篩選結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 VZV-mAb-03 和VZV-mAb-HRP-02 組合棋盤(pán)滴定法確定的A（450）值Tab.2 A(450) values identified by checkerboard titration with VZV-mAb-03 and VZV-mAb-HRP-02 （x±s）

圖1 4 種包被液包被效果的P/N 比值Fig.1 P/N ratios of coating effects of 4 kinds of coating solution

2.1.5 最適夾心抗原和酶標(biāo)抗體反應(yīng)條件3 種VZV 濃度條件下，以PBST 為樣品稀釋液所對(duì)應(yīng)的P/N 比值均為最高，因此，選擇PBST 為最適樣品稀釋液。3 種樣品稀釋液稀釋VZV 與酶標(biāo)抗體的P/N 比值見(jiàn)圖2。

表3 包被溫度和時(shí)間的A（450）值及P/N 比值Tab.3 A（450）values and P/N ratios of coating temperature and time

隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，夾心抗原和酶標(biāo)抗體的P/N 比值均呈明顯升高趨勢(shì)，2 次反應(yīng)時(shí)間分別達(dá)到60 min 時(shí)，P/N 比值增加至較高水平，且基本穩(wěn)定。因此，夾心抗原和酶標(biāo)抗體的最適反應(yīng)時(shí)間均為60 min。當(dāng)反應(yīng)溫度為37℃時(shí)，夾心抗原與酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間對(duì)應(yīng)的P/N 比值見(jiàn)圖3。

表4 封閉條件和封閉液篩選結(jié)果Tab.4 Screening results of blocking conditions and blocking solutions （x±s）

圖2 3 種樣品稀釋液稀釋VZV 和酶標(biāo)抗體的P/N 比值Fig.2 P/N ratios of 3 kinds of sample dilutions in diluting VZV and enzyme-labeled antibody

圖3 夾心抗原和酶標(biāo)抗體的反應(yīng)時(shí)間對(duì)應(yīng)的P/N 比值Fig.3 P/N ratios corresponding to reaction time of sandwich antigen and enzyme-labeled antibody

2.1.6 最適顯色條件 隨著顯色時(shí)間的增加，陽(yáng)性A（450） 值、陰性A （450） 值和P/N 比值均呈升高趨勢(shì)，但隨著時(shí)間的增加， 相鄰5 min 的陽(yáng)性A（450） 差值呈遞減趨勢(shì)，而陰性A（450）值不斷增加使得P/N 比值變化趨于平緩。 綜合陰性值＜0.1、P/N比值盡可能大這2個(gè)條件，顯色時(shí)間為10～20 min均符合要求。當(dāng)顯色15 min 時(shí)，陽(yáng)性A （450） 值接近2.0，陰性A （450） 值小于0.1，且P/N 比值較大，10 min 與15 min 的P/N 比值差值較小，因此，選擇37 ℃、15 min 為最適顯色條件。顯色溫度為37 ℃時(shí)不同顯色時(shí)間的A （450） 值和P/N 比值見(jiàn)表5。

2.2方法的初步驗(yàn)證

2.2.1 特異性 選擇Var、 凍干人用狂犬病疫苗（aG 株與PM 株）、LAIV、TIV、DPT、HPV-18型病毒純化液、 HSA、 海藻糖、 谷氨酸鈉、 蔗糖、葡萄糖、尿素、精氨酸、甘氨酸、甘露醇和NaCl進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4 和圖5，可見(jiàn)其他人用疫苗及輔料成分平均A （450） 值均＜0.2，判定為陰性（以陰性值的2.1 倍作為Cut-off 值）。該方法的檢測(cè)結(jié)果與Var 的稀釋度呈劑量依賴(lài)性，而與其他人用疫苗及其輔料成分無(wú)交叉反應(yīng)， 特異性良好。

2.2.2 線性和定量限度 經(jīng)6 批次重復(fù)檢測(cè)，抗原病毒滴度在 500～2 600 PFU·mL-1范 圍 內(nèi) 與A （450） 值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為Y1=0.000 745 8X+0.362 1、 Y2=0.000 617 0X+0.468 2、 Y3=0.000 525 0X+0.553 7、 Y4=0.000 614 6X+0.459 3、 Y5=0.000 846 4X+0.325 1、 Y6=0.000 473 4X+0.569 3，R2分 別 為0.984 3、 0.974 5、 0.960 1、 0.973 5、 0.959 3 和0.970 8， 均R2＞0.95， 定 量 限 度 為500 PFU·mL-1。見(jiàn)圖6。

2.2.3 準(zhǔn)確性和精密性批內(nèi)回收率與精密度回收率為82.2%～115.7%， 批內(nèi)CV＜10.2%， 符合定量下限與定量上限的準(zhǔn)確性與精密性為75%～125%， 其他校正點(diǎn)的準(zhǔn)確性與精密性為80%～120%。見(jiàn)表6。

表5 不同顯色時(shí)間的A（450）值和P/N 比值Tab.5 A(450) values and P/N ratios of different color reaction time

圖4 不同病毒疫苗和HSA 的平均A（450）值Fig.4 Average A（450）values of different virus vaccines and HSA

圖5 其他輔料的平均A（450）值Fig.5 Average A（450）values of other ingredients

批間回收率和精密度： 回收率為80.5%～118.6%， 板內(nèi)CV＜17.4%， 板間CV＜14.9%，符合定量下限與定量上限的準(zhǔn)確性與精密性為75%～125%， 其他校正點(diǎn)的準(zhǔn)確性與精密性為80%～120%。見(jiàn)表7。

圖6 抗原病毒滴度和A（450）值的線性回歸驗(yàn)證曲線Fig.6 Linear regression validation curves of antigen virus titer and A (450) values

3 討 論

本方法中捕獲抗體為抗VZV 糖蛋白的單克隆抗體（VZV-mAb-01、 VZV-mAb-02、 VZV-mAb-03、 VZV-mAb-04 和VZV-mAb-05）， 酶標(biāo)抗體為與其對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體（VZV-mAb-HRP-01、 VZV-mAb-HRP-02 和VZVmAb-HRP-03）， 所 有 抗 體 皆 識(shí) 別VZV 表 面 糖 蛋白，通過(guò)基因工程構(gòu)建，在CHO 細(xì)胞中表達(dá)純化后定量。經(jīng)過(guò)對(duì)8 種單抗進(jìn)行兩兩交叉篩選，得到了1 對(duì)對(duì)VZV 的特異性極好的夾心抗體—VZVmAb-03 和VZV-mAb-HRP-02，同時(shí)確定了最適包被條件、捕獲抗體最適工作濃度、最適封閉條件、最適封閉液、最適樣品稀釋液、酶標(biāo)抗體最適工作濃度及最適顯色條件，全方位地對(duì)該方法進(jìn)行了優(yōu)化，使得該方法可快速、有效地檢測(cè)VZV 糖蛋白水平。

該方法驗(yàn)證結(jié)果顯示：該方法對(duì)VZV 具有良好的特異性，而對(duì)疫苗生產(chǎn)過(guò)程中需要引入的如凍干保護(hù)劑中的小分子、大分子均無(wú)交叉反應(yīng)；將病毒滴度和A （450） 值進(jìn)行線性回歸， R2＞0.95，可見(jiàn)兩者具有顯著的線性相關(guān)性， 線性范圍內(nèi)（500～2 600 PFU·mL－1） 準(zhǔn)確性和精密性良好。

表6 批內(nèi)準(zhǔn)確性和精密性驗(yàn)證結(jié)果Tab.6 In-batch verification results of accuracies and precisions

表7 批間準(zhǔn)確性和精密性驗(yàn)證結(jié)果Tab.7 Batch to batch verification results of accuracies and precisions

以標(biāo)準(zhǔn)曲線中間點(diǎn)1 500 PFU·mL－1作為示例進(jìn)行病毒滴度計(jì)算，其回收率允許范圍為80%～120%，則回收濃度為1 200～1 800 PFU·mL－1，此時(shí)樣品稀釋倍數(shù)約為20 倍， 計(jì)算病毒滴度為4.38～4.56 lg PFU·mL－1。 對(duì)比VZV 滴定國(guó)家參考品標(biāo)示的病毒滴度為（4.3±0.5） lg PFU·mL－1，其滴度范圍為3.8～4.8 lg PFU·L－1，采用該方法檢測(cè)并計(jì)算得到的病毒滴度的范圍更精確，這更好地保證了研發(fā)過(guò)程中數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。由于ELISA法檢測(cè)針對(duì)的是病毒表面的糖蛋白水平，不能區(qū)分病毒是否具有感染性，相對(duì)蝕斑法中檢測(cè)的是具有感染性的活病毒的滴度，只采用該方法完全代替蝕斑法可能造成病毒滴度檢測(cè)結(jié)果偏高的后果。在實(shí)際工作中，可將該方法用作中間環(huán)節(jié)檢測(cè)以快速判斷病毒滴度，縮短檢測(cè)周期，加快相關(guān)研發(fā)進(jìn)程；而在質(zhì)量放行環(huán)節(jié)中，可聯(lián)合該法與蝕斑法共同檢測(cè)， 以確保樣品符合放行標(biāo)準(zhǔn)。 本研究建立的ELISA 檢測(cè)方法適合水痘病毒滅活疫苗與基因工程重組疫苗的研究，后續(xù)會(huì)進(jìn)一步研究并擴(kuò)大應(yīng)用范圍。

綜上所述，該方法的建立可低成本、快速、有效和準(zhǔn)確地檢測(cè)VZV 糖蛋白水平，為水痘疫苗的生產(chǎn)質(zhì)控及效價(jià)測(cè)定方法的替代奠定了基礎(chǔ)。