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        酶解制備苷元型大豆異黃酮

        2020-12-15 07:08:34周文紅郭咪咪畢艷紅王朝宇段章群
        中國(guó)油脂 2020年12期
        關(guān)鍵詞:物質(zhì)量糖苷異黃酮

        周文紅,郭咪咪,畢艷紅,王朝宇,段章群

        (1.國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院 糧油加工研究所,北京 102209; 2.淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江蘇 淮安 223003)

        大豆異黃酮是大豆生長(zhǎng)過程中形成的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物,以糖苷和游離苷元的形式分布于大豆的子葉和胚軸中。研究表明,游離型大豆異黃酮具有許多重要的生理功能,如預(yù)防癌癥、抗氧化、減緩女性更年期綜合征、預(yù)防骨質(zhì)疏松及心血管疾病等[1-2]。目前已發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮有12種[3],分為兩大類,即游離型苷元和結(jié)合型糖苷(其結(jié)構(gòu)式如圖1所示,存在形式如表1所示),游離型苷元包括大豆苷元、染料木素、黃豆黃素3種,占總量的2%~3%,結(jié)合型糖苷主要以葡萄糖苷、乙酰基葡萄糖苷、丙二?;咸烟擒招问酱嬖?,占總量的97%~98%[4]。由于人體吸收利用大豆異黃酮苷元的速度及數(shù)量遠(yuǎn)高于大豆異黃酮糖苷[5-6],所以游離型大豆異黃酮苷元具有更高的生理活性。近年來,大豆異黃酮的研究熱點(diǎn)也由提取技術(shù)開發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)楦咝мD(zhuǎn)化進(jìn)而制備苷元型大豆異黃酮的深加工技術(shù)研究[7-9]。

        由糖苷型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為游離型苷元的方法主要包括酸水解法、堿水解法和酶解法[10],其中酸、堿水解工藝副反應(yīng)多,限制了后續(xù)的研究利用,酶法催化工藝過程簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物穩(wěn)定性好。因此,本文重點(diǎn)研究酶催化糖苷型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元型大豆異黃酮,以期為大豆異黃酮苷元的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

        圖1 大豆異黃酮苷元型(a)和糖苷型(b)結(jié)構(gòu)式

        表1 12種大豆異黃酮的存在形式

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        大豆異黃酮糖苷(90%),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;大豆苷(D)、黃豆黃苷(Gl)、染料木苷(G)、大豆苷元(De)、黃豆黃素(Gle)、染料木素(Ge)標(biāo)準(zhǔn)品,上海源葉生物科技有限公司;甲醇、乙酸為色譜純,美國(guó)Fisher公司;β-葡萄糖苷酶(100 U/g)、β-葡萄糖苷酶(300 U/g)、β-半乳糖苷酶(10 000 U/g),上海源葉生物科技有限公司;纖維素酶(10 000 U/g),上海麥克林生化科技有限公司;纖維素酶(3 000 U/g),北京索萊寶科技有限公司。

        EClasscal 3100高效液相色譜儀,大連依利特分析儀器有限公司;IKA KS 4000搖床;AB204-S分析天平;KQ5200DE超聲波器。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 大豆異黃酮糖苷的酶解

        分別稱取大豆異黃酮糖苷100.0 mg至不同的100 mL三角瓶中,然后分別加入一定量一定pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,超聲10 min,再向不同三角瓶中加入酶,充分混勻后置于一定溫度下?lián)u床反應(yīng)一段時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束時(shí)按照酶解液與80%乙醇體積比1∶9對(duì)大豆異黃酮進(jìn)行提取,得大豆異黃酮苷元提取液。

        1.2.2 高效液相色譜檢測(cè)大豆異黃酮的條件

        色譜柱為Symmetry 300TMC18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相A為0.1%乙酸水溶液、B為0.1%乙酸-甲醇溶液,流速1 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm;柱溫40℃;流動(dòng)相梯度洗脫程序如表2所示。

        表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

        1.2.3 大豆異黃酮糖苷水解率及苷元得率計(jì)算[11]

        準(zhǔn)確稱取大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品各1.00 mg,以60%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,再用10%甲醇溶液稀釋配制成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。過0.45 μm濾膜,按1.2.2條件進(jìn)行高效液相色譜分析。以大豆異黃酮各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),大豆異黃酮各組分的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程和相關(guān)系數(shù)(R2)如表3所示。

        表3 大豆異黃酮組分標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

        取一定量1.2.1制備的大豆異黃酮苷元提取液,用10%的甲醇溶液稀釋10倍,過0.45 μm濾膜,按1.2.2條件進(jìn)行高效液相色譜分析。以保留時(shí)間定性,峰面積代入回歸方程計(jì)算各組分含量,再分別計(jì)算大豆異黃酮糖苷水解率和苷元得率。大豆異黃酮糖苷水解率=(酶解前大豆異黃酮糖苷總量-酶解后大豆異黃酮糖苷總量)/酶解前大豆異黃酮糖苷總量×100%。大豆異黃酮苷元得率=(酶解后大豆異黃酮苷元總量-酶解前大豆異黃酮苷元總量)/大豆異黃酮糖苷完全酶解應(yīng)得到的苷元總量×100%。

        1.2.4 數(shù)據(jù)處理

        數(shù)據(jù)采用Origin 8.5軟件進(jìn)行分析與作圖,每組實(shí)驗(yàn)做3次平行,數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同酶對(duì)大豆異黃酮糖苷酶解的影響

        本實(shí)驗(yàn)選取3種類型的酶進(jìn)行篩選,根據(jù)不同的酶活力一共有5種酶,分別是β-葡萄糖苷酶(100 U/g)、β-葡萄糖苷酶(300 U/g)、纖維素酶(10 000 U/g)、纖維素酶(3 000 U/g)、β-半乳糖苷酶(10 000 U/g)。在酶解溫度48℃、底物質(zhì)量濃度2 mg/mL、酶添加量10%、pH 4.8條件下酶解,研究不同酶對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率和苷元得率的影響,結(jié)果如表4所示。

        表4 不同酶對(duì)大豆異黃酮糖苷酶解效果的影響

        由表4可知,β-葡萄糖苷酶和纖維素酶都能夠酶解大豆異黃酮糖苷,二者相比,β-葡萄糖苷酶的酶解效果更好,而β-半乳糖苷酶對(duì)大豆異黃酮糖苷幾乎沒有酶解作用。對(duì)于兩種活性的β-葡萄糖苷酶,二者達(dá)到最優(yōu)催化效果的時(shí)間都在6 h,而β-葡萄糖苷酶(100 U/g)催化效果優(yōu)于β-葡萄糖苷酶(300 U/g),與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道的結(jié)果相吻合,黑曲霉來源的β-葡萄糖苷酶對(duì)大豆異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化具有較好的催化效果。β-葡萄糖苷酶(100 U/g)的價(jià)格是β-葡萄糖苷酶(300 U/g)的5倍。因此,綜合考慮選取β-葡萄糖苷酶(300 U/g)進(jìn)行大豆異黃酮糖苷的酶解實(shí)驗(yàn)。

        2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

        2.2.1 酶添加量對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率及苷元得率的影響

        在酶解溫度48℃、pH 4.8、底物質(zhì)量濃度1 mg/mL 條件下?lián)u床反應(yīng)6 h,研究不同酶添加量對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率和苷元得率的影響,結(jié)果如圖2所示。

        圖2 酶添加量對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率及苷元得率的影響

        由圖2可知,當(dāng)酶添加量從1%增加到7%時(shí),大豆異黃酮糖苷水解率和苷元得率顯著上升,水解率由64.63%增加到84.80%,苷元得率由40.65%增加到68.15%。當(dāng)酶添加量超過7%時(shí),隨酶添加量增加,水解率逐漸趨于平穩(wěn),說明在底物濃度確定的情況下,酶分子已經(jīng)能夠充分地與底物接觸反應(yīng),再增加酶添加量?jī)H增加了經(jīng)濟(jì)成本;苷元得率整體略有降低。綜合考慮,選擇酶添加量為7%。

        2.2.2 底物質(zhì)量濃度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率及苷元得率的影響

        在酶解溫度48℃、酶添加量7%、pH 4.8條件下?lián)u床反應(yīng)6 h,研究不同底物質(zhì)量濃度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率和苷元得率的影響,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,底物質(zhì)量濃度越高,底物水解率越低,與之相應(yīng)的產(chǎn)物得率也越低,這是因?yàn)樵诿该附獾孜锷僧a(chǎn)物的過程中,當(dāng)產(chǎn)物質(zhì)量濃度達(dá)到一定程度時(shí),對(duì)酶產(chǎn)生了抑制作用。研究表明,酶解生成的葡萄糖對(duì)葡萄糖苷酶有抑制作用,隨著酶解反應(yīng)進(jìn)行體系中會(huì)產(chǎn)生游離糖基和游離苷元,在達(dá)到一定質(zhì)量濃度時(shí),會(huì)抑制酶對(duì)底物的酶解能力[14-15]。另外,β-葡萄糖苷酶是一種可逆酶,在底物質(zhì)量濃度增加的同時(shí),即使產(chǎn)物得率較低,但產(chǎn)物質(zhì)量濃度已經(jīng)比較高,反應(yīng)逆向進(jìn)行,導(dǎo)致底物水解率和產(chǎn)物得率降低[16]。較低的底物質(zhì)量濃度時(shí)大豆異黃酮糖苷的水解率及苷元得率較高,但是獲得的苷元總量較少。因此,為了能夠保證在較高水解率的情況下獲得盡可能多的苷元產(chǎn)物,選擇底物質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL。

        圖3 底物質(zhì)量濃度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率及苷元得率的影響

        2.2.3 酶解溫度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率及苷元得率的影響

        在pH 4.8、酶添加量7%、底物質(zhì)量濃度1.6 mg/mL條件下?lián)u床反應(yīng)6 h,研究不同酶解溫度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率和苷元得率的影響,結(jié)果如圖4所示。

        圖4 酶解溫度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率及苷元得率的影響

        由圖4可知,隨著酶解溫度的升高,大豆異黃酮糖苷的水解率不斷提高,當(dāng)酶解溫度超過52℃時(shí)水解率開始趨于平衡,維持在96%以上。苷元得率隨著酶解溫度升高先上升后下降,在56℃時(shí)苷元得率達(dá)到最大值87.25%。綜合考慮,選擇酶解溫度56℃。

        2.2.4 pH對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率及苷元得率的影響

        在酶解溫度56℃、酶添加量7%、底物質(zhì)量濃度1.6 mg/mL條件下?lián)u床反應(yīng)6 h,研究不同pH對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率和苷元得率的影響,結(jié)果如圖5所示。

        圖5 pH對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率及苷元得率的影響

        由圖5可知,當(dāng)pH由4.0增加到4.8時(shí),大豆異黃酮糖苷的水解率由67.52%提高到94.17%,苷元得率由67.57%提高到99.47%,均明顯上升,pH繼續(xù)增大時(shí),水解率以及苷元得率開始趨于平衡,當(dāng)pH為4.8時(shí),二者均較高。因此,選擇pH為4.8。

        2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率及苷元得率的影響

        在酶解溫度56℃、酶添加量7%、底物質(zhì)量濃度1.6 mg/mL、pH 4.8條件下?lián)u床反應(yīng)一段時(shí)間,研究不同酶解時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率和苷元得率的影響,結(jié)果如圖6所示。

        圖6 酶解時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率及苷元得率的影響

        由圖6可知,隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行,水解率和苷元得率迅速提高,酶解反應(yīng)超過6 h后,水解率以及苷元得率基本趨于平衡,且均在95%以上。因此,選擇酶解時(shí)間為6 h。

        綜上所述,酶解大豆異黃酮糖苷制備苷元型大豆異黃酮的最佳工藝條件為:選擇β-葡萄糖苷酶(300 U/g),酶添加量7%,底物質(zhì)量濃度1.6 mg/mL,酶解溫度56℃,pH 4.8,酶解時(shí)間6 h。在最佳工藝條件下,大豆異黃酮糖苷的水解率及苷元得率分別達(dá)到96.84%和99.74%。

        3 結(jié) 論

        本文優(yōu)化了酶解大豆異黃酮糖苷制備苷元型大豆異黃酮的工藝。以大豆異黃酮糖苷水解率和苷元型大豆異黃酮得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),確定酶解反應(yīng)的最佳工藝條件為:采用β-葡萄糖苷酶(300 U/g),酶添加量7%,底物質(zhì)量濃度1.6 mg/mL,酶解溫度56℃,pH 4.8,酶解時(shí)間6 h。在最佳工藝條件下,大豆異黃酮糖苷的水解率及苷元得率分別達(dá)到96.84%和99.74%。大豆異黃酮糖苷酶解制備苷元的反應(yīng)條件溫和、底物水解率及產(chǎn)物得率高、操作簡(jiǎn)便、綠色環(huán)保,具有廣闊的應(yīng)用前景。

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