宋海紅 畢 瀅 何欒櫻 閆培麗 安文林 喻長遠* 王詩卉,2*

(1. 北京化工大學 生命科學與技術(shù)學院, 北京 100029;2. 北京化工大學 秦皇島環(huán)渤海生物產(chǎn)業(yè)研究院, 秦皇島 066000)

引 言

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook F),系衛(wèi)矛科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物,別名黃藤、黃藤木、黃臘藤、斷腸草等,分布于中國長江流域以南各地及西南地區(qū)[1]。 雷公藤作為一種傳統(tǒng)中藥,其味苦,有大毒,具有活血化瘀、清熱解毒、消腫散結(jié)、殺蟲止血等功效[2]。 藥理及臨床研究證實,雷公藤具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗生育等多種特性,被廣泛用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病及各種皮膚病[3]。 雷公藤甲素與雷公藤紅素是雷公藤中有效以及毒性成分。

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的常駐免疫細胞和吞噬細胞[4],各種神經(jīng)退行性疾病,包括帕金森病(Parkinson's disease,PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)和肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS),最顯著的共同特征之一是小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)炎癥[5]。 神經(jīng)炎癥現(xiàn)在被認為是一把雙刃劍,對神經(jīng)元既有害又有益。越來越多的證據(jù)表明,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞活化是不均勻的,可以分為兩種相反的類型:促炎的M1 表型和免疫抑制的M2 表型。 M1 激活的小膠質(zhì)細胞表達促炎細胞因子,驅(qū)動細胞浸潤,而M2 激活的小膠質(zhì)細胞更具有修復性,促進碎片的吞噬作用,促進與細胞穩(wěn)定性和修復相關(guān)的蛋白的表達[6]。

雷公藤提取物已被報道對多種炎癥和自身免疫性疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎有效。 雷公藤甲素和雷公藤紅素被認為是雷公藤免疫抑制和抗炎作用的主要成分。 越來越多的資料表明,雷公藤甲素和雷公藤紅素對多種組織具有很強的抗炎作用[4]。

本實驗主要探究雷公藤甲素與雷公藤紅素對小膠質(zhì)細胞HMO6 的影響,包括它們對細胞增殖、細胞膜完整性以及雷公藤甲素對小膠質(zhì)細胞M1、M2極化的影響。

1 實驗部分

1.1 實驗原料和儀器

1.1.1 實驗材料

雷公藤甲素、雷公藤紅素、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,人白細胞介素-10(IL-10)ELISA 試劑盒和人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA 試劑盒購自默沙克生物技術(shù)有限公司,小膠質(zhì)細胞(HMO6)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.2 實驗儀器

超凈工作臺(SW-CJ-1D,蘇州凈化設(shè)備有限公司),離心機(Heraeus Pico 17,Thermo Fisher 公司),酶聯(lián)免疫檢測儀(K3 Plus,BIO-DL 公司),恒溫培養(yǎng)箱(311,Thermo Fisher 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

HMO6 于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,溫度37 ℃),隔1 ～2 d 傳代1 次,選取對數(shù)生長期細胞進行實驗[7]。

1.2.2 細胞增殖實驗

按MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒說明書操作,收集對數(shù)期細胞,調(diào)整細胞懸液濃度,分于96 孔板,每孔180 μL,8 000 個細胞/孔。 置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中過夜使細胞貼壁[8]。 不同濃度雷公藤甲素或雷公藤紅素處理的細胞孔設(shè)為實驗組,未經(jīng)藥物處理的細胞孔為對照組,無細胞的培養(yǎng)液孔為空白組。 將96 孔板置于培養(yǎng)箱中孵育24 h,小心吸去上清,加入90 μL 新鮮培養(yǎng)基,再加入10 μL MTT 溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。 然后吸掉上清,每孔加入110 μL Formazan 溶解液,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。 在酶聯(lián)免疫檢測儀上于490 nm 波長處測量各孔的光密度(OD)值。 按照式(1) ～(2)計算細胞活力(A)和抑制率(B)。

式中,A 為細胞活力,B 為細胞抑制率,ODE為實驗組光密度值,ODB為空白組光密度值,ODC為對照組光密度值。

1.2.3 膜完整性實驗

本實驗通過乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒進行HMO6 細胞膜完整性的評估[9]。 乳酸脫氫酶(LDH)是一種較為穩(wěn)定的細胞質(zhì)酶,不能自由通過細胞膜,但當細胞膜受損或細胞死亡時可逃離出細胞膜,被釋放到細胞外。 LDH 釋放被看做是評價細胞膜完整性的重要指標,并被廣泛用于細胞毒性檢測。

按說明書操作,收集對數(shù)期細胞,調(diào)整細胞懸液濃度,分于96 孔板,每孔180 μL,8 000 個細胞/孔。 置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中過夜使細胞貼壁。 然后吸去培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.2 ～7.4)洗滌一次,換新鮮培養(yǎng)基(含1%血清的低血清培養(yǎng)液)200 μL,將各培養(yǎng)孔分為如下幾組:對照組(未經(jīng)藥物處理的細胞孔),空白組(無細胞的培養(yǎng)液孔),樣品最大酶活性對照組(未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細胞孔),實驗組(藥物處理的細胞孔)。 按照實驗需要給予適當濃度的藥物(雷公藤甲素與雷公藤紅素)處理,繼續(xù)按常規(guī)培養(yǎng)。 培養(yǎng)23 h 后,從細胞培養(yǎng)箱里取出細胞培養(yǎng)板,在樣品最大酶活性對照孔中加入試劑盒提供的LDH 釋放試劑20 μL。 加入LDH 釋放試劑后,反復吹打數(shù)次混勻,繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h,然后用無菌管收集各孔液體并離心,分別取各孔的上清液120 μL,加入到一新的96 孔板相應(yīng)孔中,各孔加入LDH 檢測工作液60 μL,混勻后在酶聯(lián)免疫檢測儀上于490 nm 波長處測量各孔的光密度值,并用600 nm 的波長作為參考波長。按照式(3)計算細胞LDH 的釋放量。

式中,C 為LDH 釋放量(陽性對照的百分比),ODF為樣品最大酶活性對照孔的光密度值。

1.2.4 ELISA 實驗

通過ELISA 試劑盒檢測雷公藤甲素對小膠質(zhì)細胞的M1、M2 極化的影響,實驗中LPS 質(zhì)量濃度為0.15 μg/mL。 設(shè)置對照組(未加LPS 和雷公藤甲素的細胞孔),實驗組(LPS 和不同濃度雷公藤甲素處理的細胞孔)和LPS 組(LPS 處理的細胞孔)。 將經(jīng)過處理的細胞用無菌管收集,于2 000 ～3 000 r/min 離心20 min 左右,仔細收集上清后使用試劑盒檢測。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用Origin 統(tǒng)計軟件分析,實驗結(jié)果以平均值±標準差(±SD)表示,樣本均數(shù)的比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析,P ＜0.05 說明差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 雷公藤甲素與雷公藤紅素對HMO6 細胞活力的影響

通過MTT 實驗檢測雷公藤甲素與雷公藤紅素對HMO6 細胞活力的影響,雷公藤甲素選取0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 7 個濃度進行實驗,雷公藤紅素選取0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L 7 個濃度進行實驗。

圖1 為雷公藤甲素對HMO6 細胞活力的影響,與對照組相比,當雷公藤甲素濃度為10-10mol/L 時對HMO6 細胞增殖沒有明顯的抑制作用(P ＞0.05,n=5),抑制率為(0.70 ±4.00)%;當雷公藤甲素濃度為10-9～10-5mol/L 時對HMO6 細胞增殖有明顯的抑制作用(P ＜0.01,n =5),且細胞活性隨雷公藤甲素濃度升高逐漸降低;當藥物濃度達到10-7mol/L 時,抑制率為(68.51 ±2.09)%,與文獻基本一致[10],繼續(xù)增大藥物濃度,細胞活性將進一步降低。

圖2 為雷公藤紅素對HMO6 細胞活力的影響,與對照組相比,雷公藤紅素在濃度為0 ～10-6mol/L時對HMO6 細胞增殖并無明顯的抑制作用(P ＞0.05,n=5);當藥物濃度達到10-5mol/L 時,HMO6細胞增殖明顯受到抑制(P ＜0.01,n =5),抑制率為(60.53 ±18.56)%;當藥物濃度達到10-4mol/L 時,抑制率為(71.91 ±16.28)%。

綜上所述,可以發(fā)現(xiàn)一定濃度的雷公藤甲素(10-9～10-5mol/L)與雷公藤紅素(10-5、10-4mol/L)對HMO6 的活性有顯著的影響,下文進一步探索抑制的分子機制。

2.2 雷公藤甲素與雷公藤紅素對HMO6 細胞膜完整性的影響

在上述實驗的基礎(chǔ)上,進一步探究雷公藤甲素與雷公藤紅素對HMO6 細胞膜是否具有破壞作用。雷公藤甲素選取0、10-7、10-4、10-3、10-1mol/L 5個濃度進行實驗,雷公藤紅素選取0、10-7、10-6、10-5mol/L 4 個濃度進行實驗。

圖3 為不同濃度的雷公藤甲素處理細胞后LDH 的釋放量,與對照組相比,雷公藤甲素處理的細胞LDH 釋放量并無明顯變化(P ＞0.05,n =4),說明雷公藤甲素對細胞膜無明顯的破壞作用。

圖4 為不同濃度的雷公藤紅素處理細胞后LDH 的釋放量,與對照組相比,當雷公藤紅素濃度為10-5mol/L 時,LDH 釋放量明顯增加(P ＜0.01,n=4),增加量為(8.58 ±1.56)%,與細胞增殖實驗結(jié)果基本保持一致,說明當雷公藤紅素濃度達到10-5mol/L 時,細胞膜明顯受到破壞。

根據(jù)上述實驗得出結(jié)論:雷公藤甲素(10-7～10-1mol/L)不會破壞HMO6 細胞膜完整性,而當雷公藤紅素濃度達到10-5mol/L 時會破壞HMO6 細胞膜的完整性。

2.3 雷公藤甲素對HMO6 細胞M1、M2 極化的影響

由2.2 節(jié)實驗可知,雷公藤紅素可通過破壞細胞膜的方式影響細胞活性。 而雷公藤甲素對HMO6細胞膜并無明顯破壞作用,所以進一步探究其是否對HMO6 細胞極化有影響,用雷公藤甲素處理經(jīng)LPS 誘導的HMO6 細胞,然后選擇TNF-α 作為衡量M1 型極化的指標、IL-10 作為衡量M2 型極化的指標。

本實驗選取4 個不同濃度的雷公藤甲素進行測試,探究當雷公藤甲素濃度為0、10-9、10-8、10-7mol/L 時對HMO6 細胞M1、M2 極化的影響。

圖5 為雷公藤甲素對LPS 誘導的HMO6 細胞釋放TNF-α 的影響,與LPS 組相比,當雷公藤甲素濃度為10-8、10-7mol/L 時,TNF-α 釋放量顯著減少(P ＜0.01,n=3);當雷公藤甲素濃度為10-8mol/L時,TNF-α 釋放量為(521.24 ±30.07)pg/mL;當雷公藤甲素濃度為10-7mol/L 時,TNF-α 釋放量為(264.83 ±64.25)pg/mL。

圖6 為雷公藤甲素對LPS 誘導的HMO6 細胞釋放IL-10 的影響,與LPS 組相比,當雷公藤甲素濃度為10-8、10-7mol/L 時,IL-10 釋放量顯著減少(P ＜0.05,n=3);當雷公藤甲素濃度為10-8mol/L時,IL-10 釋放量為(70.20 ±21.81)pg/mL;當雷公藤甲素濃度為10-7mol/L 時,IL-10 釋放量為(63.48 ±16.79)pg/mL。

根據(jù)上述實驗得出結(jié)論:雷公藤甲素濃度為10-8、10-7mol/L 時抑制了小膠質(zhì)細胞M1、M2 的極化,結(jié)果表明了雷公藤甲素作用機制的復雜性,與文獻結(jié)果一致[11-12]。

3 結(jié) 論

當雷公藤甲素濃度為10-9～10-5mol/L 時對小膠質(zhì)細胞活性有一定的抑制作用;當濃度為10-7～10-1mol/L 時對細胞膜完整性無明顯破壞作用;通過ELISA 實驗可知,當雷公藤甲素濃度為10-8、10-7mol/L 時,對LPS 誘導的小膠質(zhì)細胞TNF-α、IL-10 的釋放有抑制作用,說明雷公藤甲素雖然起到了一定的抗炎作用,但由于其特殊毒性,作用機理十分復雜。 當雷公藤紅素濃度達到10-5mol/L 時明顯抑制了小膠質(zhì)細胞的增殖,并且通過破壞細胞膜的方式發(fā)揮作用。

作為雷公藤的有效提取物,雷公藤甲素與雷公藤紅素在神經(jīng)免疫性疾病的治療中發(fā)揮了重要作用,可能作為治療神經(jīng)性疾病的有效藥物,但其特殊的毒副作用也應(yīng)受到高度重視。