王 祎 龐 旭 張保財(cái) 喻長(zhǎng)遠(yuǎn) 王 磊

(北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100029)

引 言

肝纖維化(hepatic fibrosis)是因慢性肝損傷而導(dǎo)致的漸進(jìn)性病理過程,可由肝炎、寄生蟲、酒精等因素誘發(fā)。 研究發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞受損后釋放多種細(xì)胞因子,包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)等,激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)后導(dǎo)致膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成與沉積,造成肝纖維化。 因此,HSC 是肝纖維化形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ),也是治療的核心靶點(diǎn)之一[1-2]。

阻止肝纖維化是防治肝硬化和肝癌的重要措施[3],但由于目前尚無有效的臨床藥物,所以抗肝纖維化藥物的研發(fā)受到了廣泛關(guān)注[4-5]。 中藥柴胡指?jìng)阈慰浦参锊窈?又名北柴胡,Bupleurum chinense DC.)或狹葉柴胡(又名南柴胡,Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根。 以柴胡為君藥的小柴胡湯被廣泛用于多種肝病的臨床治療,如病毒性肝炎、肝纖維化和肝癌等[6-8]。 Shimizu[9]證明小柴胡湯可減輕氧化應(yīng)激和抑制HSC 增殖,從而抑制肝纖維化發(fā)生。 柴胡皂苷d(saikosaponin d,SSd)是柴胡的主要活性成份之一[10-11],可通過誘導(dǎo)凋亡和自噬作用抑制癌細(xì)胞的增殖[12-14]。 李素婷等[15]報(bào)道SSd通過降低α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)含量,抑制HSC 活化和酒精性肝纖維化發(fā)生;沈艷婷等[16]認(rèn)為SSd 通過雌激素受體β(ERβ)抑制轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1(AP-1)和核因子NFκB 的表達(dá)而抑制HSC 活化。 本研究以TGF-β1 誘導(dǎo)活化的大鼠肝星狀細(xì)胞系(HSC-T6)為纖維化細(xì)胞模型,通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRTPCR)和流式細(xì)胞法等技術(shù)分析SSd 對(duì)該細(xì)胞模型的作用效果,從而為中藥柴胡的現(xiàn)代化應(yīng)用提供支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料和儀器

大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6 購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院。

SSd(CAS:20874-52-6)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(純度≥98%);TGF-β1 購自英國(guó)Abcam 公司;CCK-8 細(xì)胞增殖試劑盒、總蛋白含量檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;FastKing RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(含gDNase)、培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;Fast SYBR Green Master Mix 試劑盒購自美國(guó)Thermo Fisher 公司;CellTiter-Glo ?發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Promega 公司;Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

Rotor-GeneQ qRT-PCR 儀,德國(guó)Qiagen 公司;MoFlo XDP 高速流式細(xì)胞分選儀,美國(guó)Beckman Coulter 公 司; EnSpire 多 功 能 酶 標(biāo) 儀, 美 國(guó)PerkinElmer 公司;DL-CJ-2ND 超凈臺(tái),北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;Forma 3110 二氧化碳培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo Fisher 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SSd 母液制備

稱取1 mg SSd 溶解于20 μL 二甲基亞砜(DMSO),加入980 μL 磷酸鹽緩沖液(PBS,pH =7.4)混勻后備用。

1.2.2 HSC-T6 培養(yǎng)、活化與增殖率檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng):使用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2貼壁培養(yǎng),每48 h 更換培養(yǎng)基。 細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底80%后使用0.25%胰酶消化傳代。 后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

HSC-T6 細(xì)胞以5 000 個(gè)/孔接種于96 孔板。TGF-β1 溶于10 mmol/L 檸檬酸(pH =3.0)配制成50 μg/mL 母液。 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后去除培養(yǎng)基,用PBS 清洗后換用無血清培養(yǎng)基。 對(duì)照組不加藥物,實(shí)驗(yàn)組加入TGF-β1 或SSd +TGF-β1 培養(yǎng)24 h。更換培養(yǎng)基,每孔加入100 μL CCK-8 試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)得各復(fù)孔光密度值(OD)。 通過式(1)計(jì)算細(xì)胞增殖率(PR)。

式中,ODE為實(shí)驗(yàn)組OD450均值,ODC為對(duì)照組OD450均值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡分析

細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后去除培養(yǎng)基,用PBS 清洗后加入無血清培養(yǎng)基和TGF-β1 或SSd +TGF-β1 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 胰酶消化,800 r/min 離心10 min,收集細(xì)胞。 用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞3 次,Binding Buffer洗滌1 次。 用Binding Buffer 重懸細(xì)胞至1 ×106個(gè)/mL。 取100 μL 細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin V-FITC混勻,室溫避光孵育10 min。 加入5 μL PI,室溫避光孵育5 min 后加入390 μL PBS 混勻。 用流式細(xì)胞儀檢測(cè),并使用Summit 5.2 軟件統(tǒng)計(jì)和分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 qRT-PCR 測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄水平

分離純化細(xì)胞總RNA,經(jīng)體外一步法反轉(zhuǎn)錄為cDNA。 使用SYBR Green 為熒光標(biāo)記,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)或原癌基因abl-1 為內(nèi)參。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。 結(jié)果用2-ΔΔCT值法分析mRNA 相對(duì)含量,并以對(duì)照組為1。 qRT-PCR 引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,序列如表1所示。

表1 qRT-PCR 引物Table 1 qRT-PCR primers

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用Graphpad Prism 6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與繪圖,結(jié)果表示為±SE。 組間差異分析使用t 檢驗(yàn):* P ＜0.05,**P ＜0.01,***P ＜0.001;n. s.,P ＞0.05,無顯著性差異。 重復(fù)數(shù)N≥3。

2 結(jié)果與討論

2.1 SSd 抑制活化HSC 增殖

TGF-β1 是常用的促纖維化細(xì)胞因子,可以誘導(dǎo)HSC-T6 細(xì)胞活化,表現(xiàn)為細(xì)胞增殖與纖維化相關(guān)基因表達(dá)[17]。 為確定本研究中TGF-β1 誘導(dǎo)建模的最優(yōu)濃度,分別使用終質(zhì)量濃度為2、5 ng/mL和10 ng/mL 的TGF-β1 處理細(xì)胞24 h,使用CCK-8染色法測(cè)定增殖率。 圖1 結(jié)果顯示,TGF-β1 濃度與HSC-T6 增殖率呈正相關(guān),且于5 ng/mL 開始顯著提高細(xì)胞增殖率(圖1,11.9%;圖2,11.8%)。

將SSd 母液稀釋至終濃度為5、10 μg/mL 和20 μg/mL,分別與5 ng/mL TGF-β1 聯(lián)合處理細(xì)胞。經(jīng)24 h 測(cè)定細(xì)胞增殖率如圖2,發(fā)現(xiàn)5 μg/mL SSd顯著抑制了HSC-T6 增殖(PR = -40.3%)。 而10 μg/mL和20 μg/mL SSd 濃度組的細(xì)胞死亡率分別達(dá)到88.4%和92.7%,證明高濃度SSd 對(duì)HSC具有細(xì)胞毒性。 由于文獻(xiàn)報(bào)道中SSd 作用于HSC的最優(yōu)濃度及半數(shù)抑制濃度(IC50)均為4 μg/mL 左右[18-20],所以本研究選擇5 μg/mL SSd 與5 ng/mL TGF-β1 聯(lián)合開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 SSd 抑制纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄

使用TGF-β1 誘導(dǎo)HSC-T6 24 h 后,采用qRTPCR 對(duì)胞內(nèi)TGF-β1、PDGF、α-SMA 和Col-III 4 種纖維化相關(guān)基因的mRNA 含量進(jìn)行測(cè)定。 其中有絲分裂原PDGF 能夠促進(jìn)活化HSC 增殖分裂[21];α-SMA 是HSC 活化的主要標(biāo)志;而Col-Ⅲ是肝纖維化ECM 的主要成份之一。 結(jié)果顯示,與空白對(duì)照相比4 種mRNA 含量均有不同程度的上升,證明細(xì)胞活化程度增加(圖3)。 并且TGF-β1 誘導(dǎo)HSC-T6 活化可能存在正反饋調(diào)節(jié)現(xiàn)象,即活化后的細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步增加TGF-β1 的表達(dá)。 與TGF-β1 單獨(dú)處理相比,SSd+TGF-β1 處理顯著降低TGF-β1、PDGF和α-SMA 的mRNA 含量,說明SSd 具有抑制HSCT6 活化的作用。 但是由于SSd 不影響Col-III 的mRNA 含量,所以推測(cè)SSd 不抑制ECM 生成。

2.3 SSd 誘導(dǎo)活化HSC 凋亡

使用TGF-β1 或SSd+TGF-β1 處理HSC-T6,24 h 后采用流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果如圖4 所示,SSd 能夠顯著增加早期凋亡的細(xì)胞比率(Q4),而單獨(dú)TGF-β1 處理則增加細(xì)胞壞死比率(Q2)。 兩種處理?xiàng)l件下晚期凋亡細(xì)胞(Q1)所占比例差別不顯著。

為探究SSd 誘導(dǎo)HSC-T6 凋亡的分子機(jī)制,使用qRT-PCR 檢測(cè)胞內(nèi)bad、bax 和cas-3 3 種促凋亡基因的mRNA 水平。 盡管SSd +TGF-β1 處理組與空白對(duì)照組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5,P ＞0.05),但是SSd 仍然表現(xiàn)出增強(qiáng)促凋亡基因轉(zhuǎn)錄的趨勢(shì)。 結(jié)合流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù),上述結(jié)果表明SSd 通過激活cas-3 凋亡信號(hào)通路誘導(dǎo)HSC 發(fā)生凋亡。

2.4 SSd 降低HSC 胞內(nèi)腺苷三磷酸(ATP)含量

線粒體功能異常是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要原因[22],有文獻(xiàn)報(bào)道SSd 能夠影響線粒體正常功能并引發(fā)HSC 凋亡[23]。 使用CellTiter-Glo ?發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定胞內(nèi)ATP 相對(duì)含量(將ATP含量與蛋白質(zhì)濃度的比值進(jìn)行歸一化)分析線粒體狀態(tài),結(jié)果顯示,TGF-β1 單獨(dú)處理不影響ATP 相對(duì)含量,但SSd+TGF-β1 共同處理顯著降低了ATP濃度(圖6)。 因此,SSd 可能會(huì)抑制線粒體的能量代謝,這是誘導(dǎo)HSC 凋亡的另一原因。

2.5 討論

綜上所述,5 μg/mL SSd 能夠抑制HSC-T6 活化增殖和纖維化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,并且誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。 SSd 的作用性質(zhì)同在研的抗肝纖維化藥物相一致,如廣譜抗纖維化藥物吡非尼酮(pirfenidone)可以降低TGF-β1 表達(dá)[24];恩利卡生(emricasan)可以抑制caspase 活性和HSC 活化[25]。 在四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)建立的肝纖維化大鼠模型中,多種實(shí)驗(yàn)方案均能夠抑制HSC 活化增殖或誘導(dǎo)活化HSC 凋亡[26-28],其中聚乙二醇化腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(PEGylated TRAIL)治療能夠抑制α-SMA 表達(dá);針灸聯(lián)合姜黃素能有效抑制PDGF產(chǎn)生。 由此可見,SSd 具有治療肝纖維化的潛在臨床價(jià)值。 需要注意的是高濃度SSd 對(duì)HSC 具有明顯的細(xì)胞毒性,因此要對(duì)藥物安全性進(jìn)行充分評(píng)估。

3 結(jié) 論

柴胡皂苷d(SSd)在體外可以抑制HSC 活化和增殖,降低纖維化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。 同時(shí)SSd能夠誘導(dǎo)活化HSC 發(fā)生凋亡,其可能的機(jī)制包括激活cas-3 介導(dǎo)的凋亡通路和影響線粒體能量代謝兩條途徑。 因此,基于SSd 對(duì)HSC 的作用效果開發(fā)抗肝纖維化藥物具有較大的潛力。 本研究為中藥柴胡的現(xiàn)代化應(yīng)用提供了支持。