石思慧 郭榮欣 張 良 左曉宇 李秀金 袁海榮

(北京化工大學 北京市環(huán)境污染控制與資源化工程研究中心, 北京 100029)

引 言

2018 年,全球可再生能源增長14.5%,其中45%的增長來自中國[1]。 厭氧消化生產(chǎn)沼氣是生產(chǎn)可再生能源最為經(jīng)濟高效的方法之一,而木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)已成為厭氧消化技術(shù)中越來越重要的一種原料。 2018 年我國玉米秸稈資源量約為2.83億噸[2],有多達25%的玉米秸稈被直接燃燒或廢棄,造成了資源的巨大浪費和對環(huán)境的嚴重污染。對玉米秸稈進行厭氧消化是將其變廢為寶的有效手段之一[3]。

在厭氧消化過程中,多種微生物通過相互協(xié)作來降解有機物的現(xiàn)象被稱為微生物互營,而在互營氧化產(chǎn)甲烷過程中,種間電子傳遞(interspecies electron transfer,IET)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 微生物種間電子傳遞分為間接種間電子傳遞(mediated IET,MIET)和直接種間電子傳遞(direct IET,DIET)[4]。 傳統(tǒng)的互營理論是以H2或甲酸為電子載體的間接種間H2/甲酸轉(zhuǎn)移機制(interspecies hydrogen/formate transfer,IHT/IFT)[5],存在水解酸化慢、有機酸易積累、種間電子傳遞效率低的缺點[6]。 直接種間電子傳遞作為厭氧消化新型互營機制,被認為可以通過促進電子傳遞來提高甲烷生成率[7]。 與MIET 相比,DIET 的優(yōu)勢顯而易見,據(jù)報道,DIET 通過導電菌毛(納米導線機制)、c 型細胞色素(氧化還原蛋白機制)或利用外源導電顆粒(導電物質(zhì)介導機制)將電子從產(chǎn)酸細菌轉(zhuǎn)移到產(chǎn)甲烷菌[4],同時促進揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids,VFAs)的降解,緩解酸抑制,有效地保持產(chǎn)甲烷系統(tǒng)的穩(wěn)定。 有理論計算表明,DIET 的電子傳遞速率比IHT 高106倍[5]。

近年來,通過添加導電物質(zhì)來刺激厭氧消化中的DIET 成為研究熱點[8]。 Kato 等[9]首先提出導電材料可以刺激DIET 產(chǎn)生甲烷。 Liu 等[10]以乙醇為原料,添加顆粒活性炭進行實驗,結(jié)果表明顆?；钚蕴靠梢源龠M種間電子轉(zhuǎn)移,該研究認為顆?；钚蕴坑捎谄漭^高的電導率使得微生物之間形成的電連接導電性更強。 Yang 等[11]在厭氧污泥消化中加入顆粒狀活性炭,甲烷產(chǎn)量提高了17.4%,顆?；钚蕴康奶砑蛹涌炝怂峄彤a(chǎn)甲烷菌之間的直接電子轉(zhuǎn)移,從而提高了污泥的厭氧消化性能。 Zhang 等[12]對比了零價鐵和生銹鐵屑對污泥厭氧消化的影響,結(jié)果表明生銹鐵屑可進一步提高甲烷產(chǎn)率(提高率29.51%),高于零價鐵粉,其原因是Fe(III)氧化物可引起微生物異化鐵還原以分解復雜有機物,從而加速了厭氧過程的水解酸化,促進甲烷化作用。Yamada 等[13]研究證明了導電氧化鐵顆粒的添加有利于乙酸和丙酸酯的降解以及甲烷的生成,其認為有機酸氧化細菌與產(chǎn)甲烷古菌之間的互營作用可能加速了甲烷的生成。 可見,鐵氧化物和活性炭均能促進厭氧消化過程中的直接電子傳遞,但對于不同的原料效果不同。

然而,目前關(guān)于DIET 的研究主要集中在純有機物和廢活性污泥等原料上,對玉米秸稈等木質(zhì)纖維素類難降解原料的研究較少[14]。 因此,本文以玉米秸稈為原料,在酸化相中添加不同鐵氧化物以促進玉米秸稈的水解酸化,并在甲烷相中添加活性炭,兩者聯(lián)合應用以強化厭氧消化系統(tǒng)中的電子傳遞。通過分析酸化相產(chǎn)物以及甲烷相中的甲烷產(chǎn)量,探究鐵氧化物和活性炭對提升玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)甲烷潛力的影響。

1 材料與方法

1.1 原料

本試驗使用的玉米秸稈來自北京市順義區(qū),經(jīng)自然風干后,用粉碎機(WN-30B1,北京錕捷玉誠有限公司)粉碎至直徑約1 mm,于干燥處存放待用。用于厭氧消化試驗的接種物來自北京市順義區(qū)某沼氣站,經(jīng)自然沉降后存于4 ℃冰箱中備用。 表1 列出了玉米秸稈和接種物的性質(zhì)。 外源添加物為三氧化二鐵粉末(Fe2O3,試劑純)、四氧化三鐵粉末(Fe3O4,試劑純)和活性炭粉末(powder activated carbon,PAC,試劑純)。

1.2 試驗方法

本文試驗采用兩相厭氧消化工藝,試驗裝置如圖1 所示。厭氧反應器容積為1 L(工作容積為0.6 L),采用排水集氣法收集氣體,集氣瓶容積為1 L。

表1 玉米秸稈和接種物性質(zhì)Table 1 Characteristics of corn stover and inoculum

在酸化相中,玉米秸稈負荷(以TS 計,下同)為60 g/L,接種負荷為15 g/L,設置兩個試驗組,在一組中添加Fe2O3粉末,另一組中添加Fe3O4粉末,添加量均設置為15 g/L[12,15],加水定容至0.6 L,將反應器放入(37 ±1) ℃水浴中反應7 d,每隔12 h 搖瓶一次,同時設置空白對照組。 每日記錄氣體產(chǎn)量并測定H2含量。 酸化7 d 后,測定各反應器出料中的VFAs 濃度。 酸化相反應結(jié)束后進入甲烷相試驗。向酸化出料中加入?yún)捬踅臃N物,接種負荷為15 g/L,在兩個試驗組(Fe2O3+PAC 試驗組和Fe3O4+PAC試驗組)中分別添加10 g/L 活性炭粉末,繼續(xù)將反應器放入(37 ±1)℃水浴中進行中溫厭氧消化,設置時間為45 d,每隔12 h 搖瓶一次,每日記錄沼氣產(chǎn)量并測定氣體組分。 每個條件的所有試驗均設置3 個平行組,試驗結(jié)果為3 個平行組的平均值。

1.3 分析方法

總固體(TS)、揮發(fā)性固體(VS)依照美國公共衛(wèi)生協(xié)會《水和廢水檢驗標準方法》測定。 使用pH計(CHN868,美國Thermo Orion 公司)測量厭氧消化系統(tǒng)的pH 值。 通過元素分析儀(Vario EL micro cube elemental analyzer,德國艾力蒙塔公司)分析原料的總碳(TC)和總氮(TN)。 厭氧消化系統(tǒng)的電導率采用電導率儀(DDB-303A, 上海雷磁儀器有限公司)配電極(DJS-10C,上海雷磁儀器有限公司)進行測定。 Fe2+濃度采用鄰菲羅啉分光光度法測定。 VFAs 含量通過氣相色譜儀(GC-2014,日本島津公司)分析,儀器配備火焰離子化檢測器和DBWAX123-7032 色譜柱,以氮氣為載氣,檢測器溫度、進樣口溫度、柱溫分別為250、250 ℃和180 ℃,設置保留時間為2 min。 通過氣相色譜儀(SP2100,北京北分瑞利分析儀器有限責任公司)檢測沼氣中H2、N2、CH4和CO2的含量,采用熱導檢測器,進樣口、柱烘箱和檢測器的工作溫度分別為150、140 ℃和150 ℃,使用氬氣作為載氣。

將樣品送至上海美吉生物公司進行微生物群落分析。 細菌PCR 的上下游引物分別為338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和 806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’);古菌PCR 上下游引物分別為524F10ext(5’-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3 ’) 和 Arch958Rmod ( 5 ’-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3’)。 PCR 擴增程序為:95 ℃預變性3 min,共27 個循環(huán)(95 ℃變性30 s→55 ℃退火30 s→72 ℃延伸30 s),最后72 ℃延伸10 min。 PCR 擴增結(jié)束后,使用2%瓊脂糖凝膠回收其產(chǎn)物,經(jīng)過純化、洗脫后,再通過2%瓊脂糖電泳進行檢測,并利用QuantiFluorTM-ST 微型熒光計(美國Promega 公司)進行檢測定量。 然后根據(jù)Illumina MiSeq 平臺上的標準操作規(guī)程進行測序,分析比對數(shù)據(jù)庫為Silva(Release128),置信閾值為70%[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 添加不同鐵氧化物條件下玉米秸稈的酸化性能

玉米秸稈在酸化過程中會產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和乙醇,兩者決定了厭氧發(fā)酵類型。 添加不同鐵氧化物對玉米秸稈VFAs 與乙醇產(chǎn)量的影響如圖2 所示。 經(jīng)過7 d 的酸化,各組VFAs 產(chǎn)量最多的是乙酸,丁酸其次,兩者之和占VFAs 和乙醇總量的80%以上,故為丁酸型發(fā)酵。 丁酸型發(fā)酵較為穩(wěn)定,有利于后期甲烷化。 添加Fe3O4粉末的試驗組VFAs 與乙醇總量為9 564 mg/L,比對照組提高了25.4%,其中乙酸含量提高了27.1%, 丁酸含量提高了55.8%,丙酸含量降低了13.1%;與添加Fe2O3粉末的試驗組相比,添加Fe3O4粉末的試驗組的VFAs 與乙醇總量提高了8.5%,乙酸含量提高了6.0%,丁酸含量提高了14.7%。 Fe3O4粉末的添加有效提高了玉米秸稈水解酸化效果,在提高乙酸和丁酸產(chǎn)量的同時還減少了丙酸的生成,其可能的原因是在酸化過程中,Fe(Ш)氧化物可以富集異化鐵還原菌,該類細菌可以通過異化鐵還原過程參與到復雜有機物的降解過程中,產(chǎn)生更多小分子酸類物質(zhì),為產(chǎn)甲烷菌提供了良好的底物形式。

2.2 添加鐵氧化物和PAC 條件下玉米秸稈的甲烷化性能

在甲烷化過程中,各組日產(chǎn)沼氣量、甲烷含量和累積產(chǎn)甲烷量如圖3 所示。 可以看出,各組日產(chǎn)沼氣量趨勢相同[圖3(a)],在產(chǎn)氣過程中均出現(xiàn)兩個產(chǎn)氣高峰。 Fe3O4+PAC 試驗組啟動最快,第1 個產(chǎn)氣高峰在甲烷化開始的第5 天,比其余兩個組提前了4 d,最高日產(chǎn)氣量為1 544 mL,比對照組提高了119.3%,比Fe2O3+PAC 試驗組提高了22.4%;該組的第二個產(chǎn)氣高峰在第18 天,分別比對照組、Fe2O3+PAC 試驗組提前8 d 和2 d。 26 d 后,各組日產(chǎn)沼氣量逐漸減少,甲烷化進入后期。 在甲烷化過程中,各組甲烷含量變化呈現(xiàn)出相同的趨勢[圖3(b)],均先升高后降低最后穩(wěn)定在某一范圍。 各組最高甲烷含量均在68.0% ～69.8%之間,后期甲烷含量穩(wěn)定在52.6% ～58.5%之間,對照組與試驗組差別不大。 在甲烷化過程中,產(chǎn)甲烷效果最好的是Fe3O4+PAC 試驗組[圖3(c)],該組累積產(chǎn)甲烷量達7 965 mL,單位TS 產(chǎn)甲烷量達221 mL,與對照組相比提高了27.8%,比Fe2O3+PAC 試驗組提高了6.9%,與Zhang 等[17]的研究結(jié)果一致。

t80表示累積產(chǎn)甲烷量達到總甲烷產(chǎn)量的80%所用的時間。 Fe3O4+PAC 試驗組的t80為18 d,比對照組提前了8 d,比Fe2O3+ PAC 試驗組提前了2 d,明顯縮短了玉米秸稈厭氧消化所需時間。Fe3O4+PAC 試驗組產(chǎn)甲烷性能顯著增強,可能的原因一是酸化相中Fe3O4粉末的添加使得玉米秸稈水解酸化效率良好,VFAs 的產(chǎn)量較高,產(chǎn)甲烷菌有豐富的底物可以利用;二是由于Fe3O4粉末和PAC 具有良好的導電性能,將兩者添加到厭氧消化系統(tǒng)中可在微生物之間建立直接種間電子傳遞機制[7,15],且Fe3O4粉末和活性炭可作為電子導管,將酸化菌降解VFAs 過程中產(chǎn)生的電子直接傳遞給產(chǎn)甲烷菌[18],強化厭氧消化過程中的電子傳遞,加快VFAs的消耗和甲烷的生成,從而提升玉米秸稈生物產(chǎn)甲烷的潛力。

2.3 沼液中的鐵離子含量

鐵元素作為微量元素,可以被微生物所利用,增強水解產(chǎn)酸過程中相關(guān)酶的活性[19]。 pH 大于4時,Fe3+就會形成氫氧化鐵完全沉淀,當被還原成Fe2+后才能被微生物所利用[20]。 圖4 展示了酸化后與甲烷化后沼液中Fe2+的質(zhì)量濃度。 由于接種物中含有鐵元素,因此對照組中也有Fe2+檢出。添加鐵氧化物后,酸化相中Fe2+濃度明顯上升,添加Fe3O4試驗組的Fe2+質(zhì)量濃度約為119 mg/L,添加Fe2O3試驗組的Fe2+質(zhì)量濃度約88 mg/L,且該濃度不會對微生物造成抑制作用[21]。 Fe2+濃度的上升促進了相關(guān)酶的活性,玉米秸稈酸化效果增強,這與酸化結(jié)果一致。 與酸化相相比,甲烷化發(fā)酵后各試驗組出料沼液中Fe2+質(zhì)量濃度明顯降低,均低于15 mg/L,可能的原因一是更多的Fe2+被微生物利用;二是甲烷化過程pH 較高導致更多的鐵離子形成沉淀;三是PAC 的吸附作用使得Fe2+濃度降低。 沼液中Fe2+濃度低說明大量的鐵在沼渣中沉積,但這并不會影響沼渣的后續(xù)利用,有研究表明,土壤中鐵的背景值范圍為5 ～50 g/L,因此,即使將厭氧消化后的沼渣用作農(nóng)業(yè)用途也不會造成不良影響[12]。

2.4 厭氧消化系統(tǒng)的電導率

電導率是電子傳導能力的重要指標[22],厭氧消化系統(tǒng)的導電性能可以通過電導率來衡量,電導率越高說明系統(tǒng)的導電性能越強。 根據(jù)DIET理論,互營微生物可以利用外源導電物質(zhì)進行電子傳遞,導電物質(zhì)的添加可以增強厭氧消化系統(tǒng)的導電性能。 表2 是各試驗組分別在初始狀態(tài)時、酸化后與甲烷化后厭氧消化系統(tǒng)的電導率?？梢钥闯?經(jīng)過7 d 酸化后,各組電導率相差不大,均在7 500 ～8 200 μS/cm之間,但都明顯高于初始狀態(tài),這是因為在酸化過程中產(chǎn)生大量的可溶性酸類物質(zhì),溶液中的離子濃度增加,使得電導率顯著提高。 在甲烷化結(jié)束后,Fe3O4+PAC 試驗組的電導率最 高, 可 達10 200 μS/cm, 比 酸 化 結(jié) 束 提 高 了24.7%,高出對照組33.3%,比Fe2O3+PAC 試驗組提高了11.8%。 根據(jù)石笑羽等[22]的相關(guān)研究,在甲烷化過程中電導率變化較小,隨著反應的進行電導率略有上升,說明產(chǎn)甲烷過程中系統(tǒng)導電性能較為穩(wěn)定。 在水中添加與Fe3O4+ PAC 試驗組等量的Fe3O4粉末、活性炭粉末和接種物制成的懸濁液,測定其電導率僅為3 650 μS/cm,遠小于Fe3O4+PAC試驗組的電導率,說明厭氧消化系統(tǒng)導電性的增強不僅是因為導體物質(zhì)的添加。 有研究表明,可以通過添加Fe3O4、活性炭等導體物質(zhì)來增強厭氧消化系統(tǒng)中的導電能力,促進互營微生物之間建立DIET機制[15,23]。 Zhu 等[23]將玉米秸稈與廢活性污泥進行共發(fā)酵,并向其中添加活性炭,在厭氧消化進行到第30 天時測定電導率,結(jié)果表明,與對照組相比,試驗組的電導率顯著提高,存在構(gòu)建DIET 的巨大潛力。 結(jié)合各組產(chǎn)甲烷情況分析,Fe3O4+PAC 試驗組電導率的顯著提高說明Fe3O4粉末和活性炭粉末的添加可能加強了厭氧消化系統(tǒng)中基于DIET 的生物電連接,進一步增強了系統(tǒng)的導電性能,提高電子傳遞效率,在增加甲烷產(chǎn)量的同時縮短了甲烷化周期,改善了玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)甲烷性能。

表2 各組在初始狀態(tài)時、酸化后與甲烷化后厭氧消化系統(tǒng)的電導率Table 2 Conductivity of each group of anaerobic digestion system in the initial state, after acidification and after methanation

2.5 微生物學特性分析

為了進一步探究鐵氧化物與活性炭的添加對玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)甲烷的影響,采用高通量測序?qū)e2O3+PAC 試驗組和Fe3O4+PAC 試驗組反應器中的細菌、古菌群落進行分析,結(jié)果如圖5 所示。 從細菌群落分布圖中可以看出,Clostridium_sensu_stricto_1 豐度較高,在Fe2O3+ PAC 試驗組與Fe3O4+PAC 試驗組中的豐度分別為36.3%、39.5%,Fe3O4+PAC 試驗組略高于Fe2O3+PAC 試驗組。 Clostridium_sensu_stricto_1 為嚴格梭菌屬,可以利用糖類物質(zhì)作為碳源,生成小分子物質(zhì)供甲烷菌利用。 同時,Clostridium_sensu_stricto_1 還可參與異化鐵還原過程[24],在Fe(III)含量較高的條件下,可逐漸成為優(yōu)勢菌屬[25]。 該類細菌的存在為異化鐵還原提供了證據(jù),通過這類細菌的異化鐵還原作用可以有效促進復雜有機物的水解酸化,這與酸化相試驗結(jié)果一致。 除Clostridium_sensu_stricto_1 之外,DMER64 與Petrimonas 也是潛在的能參與DIET 的互營細菌[5,26],且Petrimonas 作為硫還原細菌,其還原潛力通常與將電子轉(zhuǎn)移到Fe(III)氧化物的能力相關(guān),在兩組試驗組中DMER64 豐度均為4.5%,Petrimonas豐度均為1.6%,這說明鐵氧化物與PAC 的添加可以富集參與DIET 的微生物,為厭氧消化系統(tǒng)中DIET 的建立提供了可能性。

圖5(b)展示了厭氧消化系統(tǒng)中古菌群落的分布,在Fe2O3+PAC 試驗組中Methanosaeta 為優(yōu)勢菌屬,豐度高達47.6%。 Methanosaeta 是典型的專性乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌,主要利用乙酸作為底物產(chǎn)甲烷[27]。 在Fe3O4+ PAC 試驗組中,Bathyarchaeia與Methanobacterium 豐度較高,分別為43.6% 和31.4%。 Bathyarchaeia 屬于泉古菌門,能夠利用多種含碳有機物,代謝能力強,還有助于抵抗環(huán)境擾動,以維持系統(tǒng)穩(wěn)定性[28]。 Methanobacterium 為耗氫產(chǎn)甲烷菌,與酸化細菌的共生營養(yǎng)可以有效促進丙酸的降解[29],這也是該組酸化相中乙酸含量上升、丙酸含量降低的原因之一。 此外,Fe3O4+PAC試驗組中還有部分耗乙酸產(chǎn)甲烷菌,包括Methanosaeta 與Methanosarcina,且Methanosarcina 比Methanosaeta 能利用更高濃度的酸類物質(zhì),底物可以被消耗得更徹底。 Methanosaeta、Methanosarcina 與Methanobacterium 均可參與DIET,有研究表明,在導電物質(zhì)與高氫分壓的誘導下,直接種間電子傳遞作用可能得到進一步增強[30-31]。 結(jié)合產(chǎn)氣效果與電導率分析,由于Fe3O4+PAC 試驗組中不僅有耗乙酸產(chǎn)甲烷菌,還有大量耗氫產(chǎn)甲烷菌的存在,使得VFAs和H2都可以得到有效利用;除此之外,Fe3O4和PAC的添加顯著提高了系統(tǒng)的導電性,促使互營微生物之間DIET 機制的建立,強化了種間電子傳遞,有效促進了玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)甲烷。

3 結(jié)論

在酸化相和甲烷相中分別添加鐵氧化物和活性炭,可以有效強化電子傳遞,提高玉米秸稈厭氧消化性能。 在酸化相中添加鐵氧化物可以強化玉米秸稈水解酸化,且Fe3O4比Fe2O3效果好,添加Fe3O4試驗組的VFAs 與乙醇總質(zhì)量濃度比對照組提高了25.4%,比添加Fe2O3的試驗組提高了8.5%。 酸化結(jié)束后加入活性炭粉末繼續(xù)進行甲烷化試驗,Fe3O4+PAC 試驗組玉米秸稈累積產(chǎn)甲烷量達7 965 mL,與對照組相比提高了27.8%,且t80比對照組縮短了8 d,電導率提高了33.3%,明顯高于普通厭氧消化系統(tǒng)的電導率。 從微生物群落角度分析,在厭氧消化系統(tǒng)中添加鐵氧化物與活性炭可以富集參與DIET 的微生物,在Fe3O4+PAC 試驗組中,細菌優(yōu)勢菌屬為Clostridium_sensu_stricto_1,古菌優(yōu)勢菌屬為Methanobacterium,這兩者可在促進DIET 的同時提高H2利用率,從而進一步提高甲烷產(chǎn)量。