本文用反相高效液相色譜檢測(cè)茶葉中蔗糖的含量，將茶葉中的蔗糖用純水提取，離心，通過0.45μm 的濾膜過濾脫氣，流動(dòng)相為水和乙腈(30：70)，流速為1.0mL/min，色譜條件為ZORBAX Carbohydrate；色譜柱4.6mm×250mm，粒度5μm；柱溫40℃；示差折光檢測(cè)器。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，得到的標(biāo)曲曲線線性關(guān)系良好，適合于茶葉中蔗糖的檢測(cè)。

茶葉味苦、甘，微寒，入心、肺、脾經(jīng)。茶葉有清熱降火、祛風(fēng)解暑的作用。治療外感風(fēng)寒引起的頭痛、鼻塞，可以用茶葉跟生姜、白芷配伍[1]。風(fēng)熱上擾引起的頭目昏痛，可用茶葉跟川芎、薄荷配伍。中暑引起的頭痛、煩躁、口渴，可以用茶葉跟西瓜皮同用。茶葉還有解毒、止瀉痢的作用，對(duì)于急性細(xì)菌性痢疾、慢性細(xì)菌性痢疾的急性發(fā)作，可以把茶葉研磨沖服。急性腹瀉、下痢不止，可以把茶葉和生姜水煎服。痔瘡出血，可以把茶葉炒焦存性，米湯送服。

近年來，蔗糖添加在茶葉(特別是紅茶)生產(chǎn)中時(shí)有發(fā)生[2]。茶葉加工中所添加的蔗糖一方面可在香氣、色澤等方面影響對(duì)成茶的感官品質(zhì)評(píng)判；同時(shí)，由于蔗糖易吸潮、易變質(zhì)和易滋生細(xì)菌等特點(diǎn)，對(duì)茶葉質(zhì)量安全有較大的影響。目前，對(duì)于基質(zhì)簡(jiǎn)單的食品中糖類成分樣品檢測(cè)可選方法相對(duì)較多；但對(duì)于基質(zhì)較復(fù)雜的食品(如茶葉等)樣品中的蔗糖檢測(cè)，由于基質(zhì)復(fù)雜，直接檢測(cè)干擾太多，很難直接檢測(cè)出蔗糖含量，一般需先分離干擾基質(zhì)再檢測(cè)，多采用液相色譜法。茶葉中含有各種糖類，是構(gòu)成茶葉滋味的重要成分之一[3]。在進(jìn)行茶葉加工的過程中，糖類發(fā)生非酶促褐變作用，生成醛和吡咯，對(duì)形成茶葉的色澤和香氣有重要影響。部分可溶性糖是影響茶湯是否醇正的主要影響因素。《食品中還原糖的測(cè)定方法》等文章介紹了檢測(cè)分析糖類的成分的幾種方法，這些方法存在一定的弊端，如時(shí)間長(zhǎng)，定量測(cè)定不準(zhǔn)，耗時(shí)耗力，無法自動(dòng)化操作，實(shí)驗(yàn)儀器昂貴使用不便等。隨著我國定量分析測(cè)定技術(shù)的提升，高效液相色譜法（HPLC）發(fā)展成為糖類檢測(cè)中最有效的方法[4]，能將多種糖類逐一分離進(jìn)行分析，能將物質(zhì)中糖類含量準(zhǔn)確地進(jìn)行定性定量分析，成為糖類分析最重要最準(zhǔn)確的方法之一。目前我國已廣泛使用高效液相色譜法（HPLC）分析食品中的糖類。

1.材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀LC1260 安捷倫科技有限公司，示差折光檢測(cè)器 安捷倫科技有限公司，ZORBAX Carbohydrate柱 4.6mm×250mm.粒度5um，默克密理博純水機(jī)，美國貝克曼離心機(jī)，超聲脫氣機(jī)，梅特勒電子天平

1.2 試劑

蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品、乙腈、蒸餾水

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

市售茶葉

1.4 色譜柱的前處理

用已配制好的水和乙腈(30：70)緩沖溶液過0.45μm 的濾膜超聲處理之后脫氣，以1.000mL/min 的流速洗柱12h保持柱溫40℃。

1.5 色譜條件

流動(dòng)相：水和乙腈(30：70)，流速為1.0mL/min

色譜柱：ZORBAX Carbohydrate 柱 4.6mm×250mm.粒度5μm，柱溫40℃

示差折光檢測(cè)器

進(jìn)樣量：20μL。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制

1.6.1 蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（20mg/mL）：

稱取蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品0.2g（精確至0.0001g）于10mL 容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，濃度為20mg/mL，有效期一個(gè)月，4℃冰箱保存。

1.6.2 蔗糖標(biāo)準(zhǔn)使用液：

分別吸取蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.5mL、5mL 于50mL 容量瓶中，用水定容。分別相當(dāng)于：0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL 濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)溶使用液系列各20μL，進(jìn)行HPLC 分析，然后以峰面積為縱坐標(biāo)，蔗糖的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，化學(xué)工作站完成，建立校正表[5]。

1.6 樣品前處理及檢測(cè)

取市售茶葉5g 加20mL 水，超聲30min，靜置，待冷卻后取上清液于離心管中，以4000r/min 離心10 分鐘，取上清液于50mL 容量瓶中，重復(fù)一遍，合并上清液。然后用0.45μm 濾膜過濾后脫氣待測(cè)。取蔗糖樣品20μL 進(jìn)樣檢測(cè)峰面積。

2.結(jié)果與分析

2.1 線性回歸方程和檢出限

通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品和茶葉樣品的進(jìn)樣，得標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和茶葉樣品色譜圖。其中，檢測(cè)限是分析物蔗糖的信噪比為 3(S/N=3)時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度。結(jié)果表明，蔗糖的檢測(cè)線性回歸方程的相關(guān)性良好，檢出限為 0.10 g/100 g。

表1 不同蔗糖含量對(duì)應(yīng)得峰面積

圖1 峰面積—標(biāo)準(zhǔn)蔗糖濃度mg/mL

其中Y 為峰面積，X 為濃度（mg/mL） 將樣品峰面積Y 代入公式求X，可以得到茶葉中蔗糖的濃度C。

表2 線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.2 結(jié)果計(jì)算

X=c×V/（m×10）

式中：

X---試樣中蔗糖的含量，單位（g/100g）；

c---由標(biāo)準(zhǔn)曲線查的試樣進(jìn)樣液中蔗糖的濃度，單位（mg/mL）；

V---試樣定容體積，單位（mL）；m---試樣質(zhì)量，單位（g）；10---換算系數(shù)。

結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

表3 不同茶葉中蔗糖的含量

如圖所示，疑似摻糖茶葉蔗糖含量為1.918g/100g，自制摻糖茶葉蔗糖含量為2.303g/100g，秀水天香茶葉蔗糖含量為0.378g/100g，武當(dāng)山茶葉蔗糖含量為0.377g/100g。其中自制茶葉加糖前后蔗糖含量對(duì)比明顯。秀水天香茶葉與武當(dāng)山茶葉受海拔、土壤、光照及降水[6]等種植條件的影響，蔗糖含量明顯高于自制茶葉。

2.3 回收率實(shí)驗(yàn)

以秀水天香綠茶為綠茶的基質(zhì)，在最優(yōu)條件下進(jìn)行 3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)

水平重復(fù) 6 次，按 1.6 方法處理，加標(biāo)結(jié)果分別見表 4。結(jié)果表明，蔗糖的回收率在 87.9 %～98.6 %之間，RSD %在 1.33 %～2.14 %之間。

表4 綠茶中蔗糖的加標(biāo)回收率

3 討論

3.1 流動(dòng)相及流速的選擇

水和乙腈(30：70)體系對(duì)蔗糖有較好的溶解度和選擇性，和別的雜質(zhì)有較好的分離度。選擇流速時(shí)，對(duì)峰形對(duì)稱性有影響[7]，由于液相色譜的柱長(zhǎng)250mm，柱徑4.6mm 已經(jīng)確定，就須選擇與之柱子匹配的流量，一般對(duì)于250mm、4.6mm、5μm 的填料最佳流量為1.000mg/min。

3.2 色譜柱的選擇

本次實(shí)驗(yàn)采用安捷倫ZORBAX Carbohydrate 糖分析專用柱。糖分析柱具有重現(xiàn)性好、高效和使用靈活的特點(diǎn)。每一批這種特殊用途的氨基丙基柱填料都要經(jīng)過分離單糖和二聚糖的測(cè)試。這個(gè)色譜柱采用ZORBAX 多孔硅膠微球技術(shù)[8]。糖分析柱可進(jìn)行大體積進(jìn)樣，4.6 x 150 mm 色譜柱可以進(jìn)樣50 μL。

3.3 適宜溫度

實(shí)際分析中改變柱溫對(duì)液相色譜的分離選擇性，分離速度，流動(dòng)相黏度，柱前壓等均會(huì)產(chǎn)生影響。色譜柱溫太高，流動(dòng)相黏度降低，有利于增大柱的通透性，可加快分析速度，可在一定程度上提供分離選擇性，但是會(huì)降低色譜柱的使用壽命，一般設(shè)置溫度為室溫，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置溫度為40°

3.4 定性定量方法

以保留時(shí)間進(jìn)行定性，通過對(duì)比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰[9]，來確定試樣中是否含有蔗糖及在色譜圖中的保留位置。此實(shí)驗(yàn)用外標(biāo)法進(jìn)行定量，在一定的色譜條件下，檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)，即色譜圖上的峰面積與進(jìn)入檢測(cè)器的濃度成正比，這是蔗糖定量的基礎(chǔ)，對(duì)樣品進(jìn)行定量有歸一化法，外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法；歸一化法要求對(duì)樣品中所有組分全部出峰，由于該方法使用的標(biāo)準(zhǔn)試劑是分析純，含有的雜質(zhì)較多，有歸一化法定量將產(chǎn)生較大的誤差。內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確度較高，但對(duì)于每個(gè)試樣的分析，都要先進(jìn)行2 次稱量[10]，不適合大批量樣品的快速分析。外標(biāo)法配置一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分析，外標(biāo)法不使用校正因子，準(zhǔn)確度較高，但操作條件變化對(duì)準(zhǔn)確性影響較大，適用大批量試樣的快速分析，因此本實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

3.5 注意事項(xiàng)

由于流動(dòng)相是分析純其中雜質(zhì)較多[11]，使一些譜圖出現(xiàn)前伸峰；柱溫的不穩(wěn)定這些因素導(dǎo)致蔗糖的保留時(shí)間有所差別，在精度要求的范圍內(nèi)均影響不大。本實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法[12]進(jìn)行定量，確定了RP—HPLC 與其它物質(zhì)的最佳分離條件，此方法準(zhǔn)確度較高適用于大批量試樣的快速分析，適合于茶葉中蔗糖含量的測(cè)定[13]。

3.6 結(jié)論

利用本實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)本地綠茶100 批次的檢測(cè)，得出蔗糖含量在5%～1%之間的樣品，為可疑摻糖樣品，含量在1%以上的，可以基本確定摻雜了蔗糖。