畢振威 徐立波 夏興霞

摘要：為了制備鑒別犬瘟熱病毒（CDV）流行強毒株和疫苗弱毒株的單克隆抗體，將CDV 851弱毒株濃縮后經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化，免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞進行細(xì)胞融合，經(jīng)3～5次克隆，間接ELISA篩選，獲得穩(wěn)定分泌抗CDV的雜交瘤細(xì)胞2D12株。該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體亞類為IgG1κ，與常見犬病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)。間接免疫熒光顯示，單克隆抗體與CDV 851毒株發(fā)生特異性反應(yīng)，與桿狀病毒表達的CDV 851毒株H蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體與2株CDV強毒株H蛋白不發(fā)生反應(yīng)，而與2株CDV弱毒株H蛋白有特異性反應(yīng)。雙抗體夾心ELISA顯示，單克隆抗體能檢測CDV疫苗弱毒株而不能檢測CDV強毒株。病毒中和試驗證實，單克隆抗體對CDV 851弱毒株具有中和能力。制備了區(qū)分CDV強毒株和疫苗弱毒的單克隆抗體，為CDV的鑒別診斷技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：犬瘟熱病毒;單克隆抗體;流行毒株;疫苗毒株;鑒別檢測

中圖分類號： S852.65? 文獻標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0178-05

犬瘟熱（canine distemper，簡稱CD）是由犬瘟熱病毒（canine distemper virus，簡稱CDV）引起的急性、高度接觸性傳染病。CDV自然感染宿主范圍廣泛，除了食肉目所有8個科外，還擴展到偶蹄目豬科、靈長目的獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動物，給養(yǎng)犬行業(yè)、經(jīng)濟動物行業(yè)和野生動物保護業(yè)等造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。CD是由流行的CDV野毒株感染引起的，而CD的免疫預(yù)防普遍使用活疫苗，如CDV疫苗弱毒株Onderstepoort、CDV3等。CDV疫苗弱毒株的毒力減弱而不引起免疫犬CD發(fā)病，但能提供有效的免疫保護。在臨床中，CD疑似犬中檢測和分離的CDV毒株并不一定是致病毒株，很多臨床分離株與疫苗株具有很高的同源性和親緣關(guān)系[2-3]，表明犬感染CDV弱毒株的情況可能比較普遍，也可能分離的毒株就是免疫接種的疫苗弱毒株。目前，鑒別和區(qū)分CDV野毒株和疫苗弱毒株的檢測方法很少。通過對CDV的基因測序能確定毒株的基因型[4]，但費時、費力，無法實現(xiàn)快速準(zhǔn)確診斷，對CD的診斷和治療造成一定的困難。在檢測CDV血清抗體時，也無法判斷是CDV疫苗弱毒株還是CDV野毒株產(chǎn)生的抗體。因此，有效區(qū)分CDV強弱毒株是目前亟待解決的重要問題。本研究選用與CDV野毒株存在抗原性差異的 CDV 851 弱毒株免疫小鼠，制備能與CDV弱毒株發(fā)生特異性反應(yīng)而與CDV野毒株沒有反應(yīng)的單克隆抗體，為區(qū)分CDV強弱毒株提供必要的工具。

1 材料與方法

1.1 病毒及主要試劑

Vero細(xì)胞長期傳代致弱的CDV851毒株由筆者所在實驗室保存;6～8周齡BALB/c小鼠購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心;小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由筆者所在實驗室保存;抗CDV N蛋白單克隆抗體由筆者所在實驗室制備[5];HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體為KPL產(chǎn)品;弗氏完全與不完全佐劑、PEG4000、RPMI-1640培養(yǎng)基、HAT和HT均購自Sigma公司;TMB顯色液購自南京碧云天生物技術(shù)有限公司;單抗亞型鑒定試劑盒為Thermo公司產(chǎn)品;鼠源抗Flag標(biāo)簽抗體購自Sigma公司;FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司;同源重組克隆試劑盒（One Step Cloning Kit-C112）、高保真DNA聚合酶（Phanta Max supper-fidelity DNA polymerase）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;表達CDV 851毒株H蛋白的桿狀病毒按參考文獻[6]構(gòu)建和鑒定;7份CDV陽性臨床樣品來自山東煙臺和江蘇南京的寵物醫(yī)院。

1.2 抗原純化和動物免疫

將CDV 851毒株接種于Vero細(xì)胞大量培養(yǎng)。根據(jù)文獻[7]的方法，采用醋酸鋅沉淀濃縮病毒，經(jīng)蔗糖密度梯度離心，純化和制備CDV抗原。將純化的CDV抗原用等體積弗氏完全佐劑乳化，腹腔注射免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠，劑量為50 μg/只。以后每隔14 d用等體積弗氏不完全佐劑進行乳化，再免疫2次。3免后間隔7 d斷尾采血，測定血清抗體效價。取免疫小鼠血清和正常BALB/c小鼠血清作為陽性血清和陰性血清。于2011年5月10日至2011年6月21日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所進行。

1.3 細(xì)胞融合、篩選與克隆

取CDV免疫的BALB/c小鼠的脾臟，制備脾細(xì)胞。根據(jù)文獻[7]方法，采用PEG4000將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進行細(xì)胞融合。用純化的CDV 851株抗原作為包被抗原，間接ELISA方法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，選擇2次檢測結(jié)果均為陽性的雜交瘤細(xì)胞株。采用有限稀釋法對陽性孔進行3～5次亞克隆，至克隆后所有細(xì)胞孔上清陽性率100%。將克隆化的CDV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株進行擴大培養(yǎng)，腹腔注射到石蠟致敏的8～10周齡的BALB/c小鼠，7～10 d后收集小鼠腹水，離心后收集上清，分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?011年6月21日至2011年8月25日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所進行。

1.4 單克隆抗體的效價和亞類測定

用間接ELISA測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和單克隆抗體腹水的效價。按照單克隆抗體亞類鑒定試劑盒操作說明書，測定雜交瘤細(xì)胞2D12株分泌單克隆抗體的亞類。于2011年9月1日至2011年9月7日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所進行。

1.5 單克隆抗體的間接免疫熒光試驗

將Vero細(xì)胞鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同步接種CDV 851株，培養(yǎng)48 h，病變后吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的無水乙醇于4 ℃下固定30 min，用PBS洗3次;加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次;加入200倍稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌5次，置于熒光顯微鏡下觀察。將Sf9昆蟲細(xì)胞鋪到24孔板中，接種表達CDV 851毒株H蛋白的桿狀病毒，按以上相同的方法進行間接免疫熒光試驗。于2011年8月26日至2011年9月1日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所進行。

1.6 單克隆抗體的Western blot檢測

分別用RT-PCR方法擴增CDV 851、疫苗株Onderstepoort以及Asia-4型野毒株NJ（11）2和Asia-1型野毒株NJ（12）3的H基因，采用同源重組的方法克隆到真核表達載體pCAGGS載體上，構(gòu)建pCAGGS-Flag-H真核表達質(zhì)粒。將293T細(xì)胞鋪到細(xì)胞板中，次日細(xì)胞長至60%，分別轉(zhuǎn)染以上4個毒株H蛋白的真核表達質(zhì)粒，48 h后裂解細(xì)胞，加蛋白上樣緩沖液煮10 min，進行Western blot檢測。一抗為雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用ECL顯色試劑盒進行顯影。于2019年4月7日至2019年5月13日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所進行。

1.7 單克隆抗體的ELISA方法

用HisTrapTM Protein G親和層析柱純化單克隆抗體，按5 μg/mL的濃度包被ELISA板，用10%小牛血清的PBST在37 ℃封閉2 h，PBST洗3次，加入CDV陽性樣品，37 ℃作用1 h，PBST洗3次，然后加入HRP標(biāo)記的抗CDV N蛋白單克隆抗體G3N[7]，37 ℃作用1 h，PBST洗3次，進行ELISA顯色。同時，用雙抗體夾心ELISA試驗檢測犬細(xì)小病毒（CPV）、犬流感病毒（CIV）、犬腺病毒1型（CAV-1）和犬冠狀病毒（CCV），檢驗單克隆與犬常見病毒的交叉反應(yīng)性。于2019年6月9日至2019年6月30日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所進行。

1.8 病毒中和試驗

測定CDV 851株的TCID50，確定其病毒滴度。采用固定病毒稀釋抗體的方法檢測單克隆抗體的中和活性。將Vero細(xì)胞消化后，接種于96 孔細(xì)胞板中。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清按2倍倍比稀釋，單克隆抗體腹水按10倍倍比稀釋。將不同稀釋度的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和單克隆抗體腹水分別與等體積含200 TCID50的CDV 851株懸液混合均勻，37 ℃作用1 h，取該病毒-抗體混懸液按0.1 mL/孔接種于上述96孔細(xì)胞板中，并設(shè)立CDV及正常Vero細(xì)胞對照，置37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)，5～7 d后觀察結(jié)果。于2011年9月15日至2011年9月30日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單克隆抗體的篩選、效價和亞類

融合的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過3～5次克隆篩選，獲得分泌抗CDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞2D12株。用間接ELISA測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價是 1 ∶ 103，單克隆抗體腹水的效價是1 ∶ 107。亞類試劑盒鑒定單克隆抗體的重鏈亞類為IgG1，輕鏈亞類為κ型。將雜交瘤細(xì)胞傳代20代以上，用間接ELISA抗體檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液，結(jié)果分泌的抗體效價沒有明顯變化，表明該雜交瘤細(xì)胞株具有穩(wěn)定分泌單克隆抗體的能力。

2.2 單克隆抗體的特異性

采用間接免疫熒光試驗（IFA），檢測單克隆抗體的特異性。雜交瘤細(xì)胞2D12株培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)上清與CDV 851毒株感染的Vero細(xì)胞進行間接免疫熒光試驗，結(jié)果表明，單克隆抗體2D12與 CDV 851 毒株感染的Vero細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，而與正常Vero細(xì)胞沒有綠色熒光（圖1），表明單克隆抗體與CDV 851毒株發(fā)生特異性反應(yīng)。將表達 CDV 851 毒株H蛋白的重組桿狀病毒感染sf9細(xì)胞，間接免疫熒光試驗顯示，雜交瘤細(xì)胞2D12株培養(yǎng)的細(xì)胞上清與之發(fā)出綠色熒光，而與正常的sf9細(xì)胞無綠色熒光，表明單克隆抗體與CDV 851毒株H蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)（圖2）。用雙抗體夾心ELISA檢測犬細(xì)小病毒（CPV）、犬流感病毒（CIV）、犬腺病毒1型（CAV-1）和犬冠狀病毒（CCV），結(jié)果均為陰性，表明該單克隆抗體與犬常見病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.3 單克隆抗體與不同CDV毒株的反應(yīng)性

將表達CDV 851毒株、疫苗株Onderstepoort以及Asia-4型野毒株NJ（11）2和Asia-1型野毒株NJ（12）3的H蛋白的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后收獲細(xì)胞樣品，進行Western blot試驗。結(jié)果表明，單克隆抗體與CDV 851毒株、Onderstepoort毒株H蛋白在70 ku左右出現(xiàn)特異性條帶，與H蛋白預(yù)期大小相符，而與CDV NJ（11）2毒株、CDV NJ（12）3毒株沒有出現(xiàn)條帶（圖3-A、圖3-B）。用Flag抗體檢測CDV NJ（11）2毒株、CDV NJ（12）3毒株H蛋白，在70 ku左右出現(xiàn)特異性條帶，表明這2個毒株的H蛋白得到表達（圖3-C）。以上結(jié)果表明，單克隆抗體特異性地識別弱毒株CDV 851和疫苗株Onderstepoort的H蛋白，但是與CDV野毒株NJ（11）2和NJ（12）3毒株不發(fā)生特異性反應(yīng)。為了進一步檢測單克隆抗體與CDV野毒株的反應(yīng)性，用該單克隆抗體建立雙抗體夾心ELISA方法，檢測9份犬臨床CD樣品，檢測結(jié)果均為陰性，空白對照也為陰性;而檢測CDV弱毒株CDV 851和Onderstepoort株時，則為CDV陽性（圖4-A）。用之前建立的雙抗體夾心ELISA[7]檢測，則均為CDV陽性（圖4-B）。以上結(jié)果進一步確定單克隆抗體能夠識別CDV疫苗弱毒株，而不能識別臨床CDV野毒株。

2.4 單克隆抗體的中和活性試驗

用CDV 851毒株在Vero細(xì)胞上進行病毒中和試驗，檢測單克隆抗體的病毒中和活性。雜交瘤細(xì)胞2D12株培養(yǎng)上清液按2倍倍比稀釋，測得的中和效價是1 ∶ 256;單克隆抗體腹水按10倍倍比稀釋，單克隆抗體腹水的中和效價為1 ∶ 106。

3 討論與結(jié)論

CDV引起犬和其他陸生食肉動物產(chǎn)生呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)臨床癥狀，危害嚴(yán)重。CDV H蛋白是刺激機體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白[8-9]。但是，H基因的變異率很高，不同CDV毒株之間H基因的變異性高達11%。因此，H基因已經(jīng)被廣泛的用于研究CDV的分子流行病學(xué)和遺傳進化[1]。CDV是副黏病毒科麻疹病毒屬的RNA病毒，容易發(fā)生變異。近年來，新的CDV基因型不斷地出現(xiàn)。到目前為止，基于H基因的進化顯示CDV至少有17個不同的基因型，即America-1型（包括幾乎所有的商業(yè)現(xiàn)有疫苗株）、America-2～5型、Arctic-like型、Rockborn-like型、Asia-1～4型、Africa-1和2型、Europe wild型、Europe/South America-1型、South America-2和3[1，4-5]。目前，中國流行的CDV毒株主要是Asia-1型CDV[4]。H基因的多樣性也影響到了抗原性，單克隆抗體鑒定不同CDV毒株H蛋白存在抗原差異性[10-12]。本研究用CDV 851弱毒株制備的單克隆抗體2D12能區(qū)分CDV疫苗弱毒株和CDV野毒株，且對該毒株具有中和活性?？紤]到H蛋白的免疫保護性和較高的抗原變異性，用桿狀病毒表達的CDV 851株H蛋白檢測與單克隆抗體2D12的反應(yīng)性，結(jié)果為陽性，說明該單克隆抗體結(jié)合的是H蛋白。

CD疫苗的使用很好地控制了該病。最近在全世界包括我國，頻繁地出現(xiàn)CD病例，之后較大規(guī)模爆發(fā)，包括家養(yǎng)動物和野生動物，甚至是在接種疫苗的動物上。Li等分離的9株CDV野毒株，其中3個毒株是來自免疫犬[13]。交叉中和試驗結(jié)果表明，CDV野生型分離株之間以及CDV野生型分離株與美國目前使用的疫苗株之間存在抗原差異[14]。本研究制備的單克隆抗體與疫苗弱毒株反應(yīng)而與野毒株不反應(yīng)，表明單克隆抗體識別的中和抗原表位在野毒株上已經(jīng)發(fā)生變異。目前CDV疫苗仍然有效，但是中和抗原表位的改變可能會降低或者減弱疫苗的免疫效率。

Chen等從15只犬中擴增到15個CDV毒株的H基因，其中9個CDV毒株屬于Asia-1型，而4個毒株與Onderstepoort毒株有著最近的關(guān)系[2]。事實上，在對NCBI中注冊的CDV毒株進行遺傳進化分析，發(fā)現(xiàn)很多毒株都與疫苗弱毒株有著非常近的關(guān)系[3]。臨床CDV強弱毒株無法有效鑒別，嚴(yán)重影響CDV診斷的準(zhǔn)確性。曲叢華等建立了鑒別CDV強弱毒株的熒光定量PCR方法[15]。本研究制備的單克隆抗體能用來鑒別CDV疫苗弱毒株和流行野毒株。鑒定該單克隆抗體識別的CDV中和表位，用該表位建立間接ELISA方法可區(qū)分CDV強弱毒株感染產(chǎn)生的抗體，也可用該單克隆抗體建立競爭ELISA方法區(qū)分CDV強弱毒株產(chǎn)生的抗體，具體研究正在進行中。

H蛋白主要影響CDV的抗原性、宿主范圍和組織嗜性，其高變異率使CDV種間傳播現(xiàn)象加劇[16]。單克隆抗體通過不同的機制對病毒起到中和作用，如阻斷H蛋白與受體的結(jié)合，干擾H蛋白與F蛋白的結(jié)合而抑制病毒與細(xì)胞的融合以及改變病毒蛋白構(gòu)象等[17]。本研究制備的單克隆抗體2D12也具有中和活性，但其具體的機制須要通過受體結(jié)合試驗、細(xì)胞融合試驗、表位鑒定等試驗來進一步研究闡明。

參考文獻：

[1]Rendon-Marin S，da Fontoura B R，Canal C W，et al. Tropism and molecular pathogenesis of canine distemper virus[J]. Virology Journal，2019，16（1）：30.

[2]Chen M，Xin T，Hou S，et al. Genotyping and pathogenic characterization of canine distemper virus based on mutations in the hemagglutinin gene in Chinese domestic dogs[J]. Polish Journal of Veterinary Sciences，2018，21（3）：623-629.

[3]周 莉，劉志杰，曾智勇，等. 犬瘟熱病毒貴州分離株H基因的克隆及其序列分析[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2011，32（7）：19-24.

[4]Zhao J J，Yan X J，Chai X L，et al. Phylogenetic analysis of the haemagglutinin gene of canine distemper virus strains detected from breeding foxes，raccoon dogs and minks in China[J]. Veterinary Microbiology，2010，140（1/2）：34-42.

[5]Bi Z，Wang Y，Pan Q，et al. Development of CDV-specific monoclonal antibodies for differentiation of variable epitopes of nucleocapsid protein[J]. Veterinary Microbiology，2017，211：84-91.

[6]畢振威，王永山，范紅結(jié). 犬瘟熱病毒核衣殼蛋白基因在昆蟲細(xì)胞中的表達及其抗原性分析[J].中國動物傳染病學(xué)報，2011，19（5）：21-26.

[7]畢振威. 犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備及其應(yīng)用[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[8]Bi Z W，Wang Y S，Wang X L，et al. Phylogenetic analysis of canine distemper virus in domestic dogs in Nanjing，China[J]. Archives of Virology，2015，160（2）：523-527.

[9]Sixt N，Cardoso A，Vallier A，et al. Canine distemper virus DNA vaccination induces humoral and cellular immunity and protects against a lethal intracerebral challenge[J]. Journal of Virology，1998，72（11）：8472-8476.

[10]Iwatsuki K，Tokiyoshi S，Hirayama N，et al. Antigenic differences in the H proteins of canine distemper viruses[J]. Veterinary Microbiology，2000，71（3/4）：281-286.

[11]Bi Z W，Xia X X，Wang Y S，et al. Development and characterization of neutralizing monoclonal antibodies against canine distemper virus hemagglutinin protein[J]. Microbiology and Immunology，2015，59（4）：202-208.

[12]Shi P，Cao Z G，Cheng Y，et al. Identification of linear B-Cell epitopes on hemagglutinin protein of canine distemper virus using two monoclonal antibodies[J]. Frontiers in Veterinary Science，2020，7：47.

[13]Li W，Cai C，Xue M，et al. Phylogenetic analysis of canine distemper viruses isolated from vaccinated dogs in Wuhan[J]. Journal of Veterinary Medical Science，2018，80（11）：1688-1690.

[14]Anis E，Holford A L，Galyon G D，et al. Antigenic analysis of genetic variants of Canine distemper virus[J]. Veterinary Microbiology，2018，219：154-160.

[15]由叢華，張傳美，張洪亮，等. 鑒別犬瘟熱病毒強弱毒株SYBR Green Ⅰ 熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)雜志，2017，53（3）：23-25.

[16]王雅文，趙建軍，閆喜軍. 犬瘟熱病毒受體及其跨宿主感染[J].病毒學(xué)報，2017，33（3）：477-482.

[17]Ader-Ebert N，Khosravi M，Herren M，et al. Sequential conformational changes in the morbillivirus attachment protein initiate the membrane fusion process[J]. PLoS Pathogens，2015，11（5）：e1004880.王大鵬，唐章生，林 勇，等. 不同投飼方式對克氏原螯蝦稻田冬繁產(chǎn)量和水質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（20）：183-187.