朱琳 劉東升 朱旭江 蘇蕊 姚世霞 賀軍權(quán) 楊平榮

【摘 要】 目的： 提高當(dāng)歸腹痛寧滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：修改原有當(dāng)歸藥材的薄層鑒別方法;采用氣相色譜法建立二氯甲烷溶劑殘留的檢查項(xiàng);采用高效液相色譜法建立當(dāng)歸腹痛寧滴丸中主成分藁本內(nèi)酯的含量測(cè)定項(xiàng)。結(jié)果：修改后的薄層色譜分離良好，斑點(diǎn)清晰;氣相色譜法檢測(cè)當(dāng)歸腹痛寧滴丸中二氯甲烷的最低檢出限為3.15 μg·mL-1;藁本內(nèi)酯在0.1064～2.1290 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.9999以上，加樣回收率n=9）為98.0%（RSD=2.6%）。結(jié)論：通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)便可靠，重復(fù)性好，適用于當(dāng)歸腹痛寧滴丸的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 當(dāng)歸腹痛寧滴丸;當(dāng)歸;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);藁本內(nèi)酯;二氯甲烷溶劑殘留

【中圖分類號(hào)】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2020）20-0032-07

Improvement of Quality Standard of Danggui Futongning Droplet Pills

ZHU Lin1，2 LIU Dongsheng1，2 ZHU Xujiang1，2 SU Rui1，2 YAO Shixia1，2 HE Junquan1，2 YANG Pingrong1，2

1.Gansu Institute for Drug Control，Lanzhou 730070，China;

2.Gansu Inspection and testing technical engineering laboratory for Chinese herbal and Tibetan medicine， Lanzhou 730070， China

Abstract：Objective To improve the quality standard of Danggui Futongning Droplet Pills.Methods The TLC（thin layer chromatography） identification method of Angelica sinensis was improved， the detection items of residual dichloromethane solvent were established by gas chromatography， and the content determination method of ligustilide was established by liquid chromatography.Results The TLC of Angelica sinensis was well separated and the spots were clear; The minimum detection limit of dichloromethane in Danggui Futongning droplet pills by gas chromatography is 3.15 μg·mL-1; The calibration curves of ligustilide were in a good linearity，

R>0.999

and the average recovery rate was 98.0% （RSD=2.6%）.Conclusion The method is simple， reliable and reproducible.It is suitable for the quality control of Danggui FuTongning Droplet Pills.

Keywords：Danggui Futongning Droplet Pills; Angelica; Quality Standard; Ligustilide; Residue of Dichloromethane Solvent

當(dāng)歸腹痛寧滴丸具有解痙止痛的功效，主要用于婦女痛經(jīng)、產(chǎn)后宮縮痛、感染性腹瀉引起的急性腹痛、小兒秋季腹瀉等的治療。原標(biāo)準(zhǔn)收載于甘肅省藥品標(biāo)準(zhǔn)1988年版。1998年收載入衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十七冊(cè)，此標(biāo)準(zhǔn)沿用至今，此標(biāo)準(zhǔn)中收載性狀、鑒別（當(dāng)歸）和檢查項(xiàng)，標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單，不足以控制當(dāng)歸腹痛寧滴丸的質(zhì)量。所以有必要提高現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)歸腹痛寧滴丸是以當(dāng)歸揮發(fā)油為主要原料制成的滴丸劑，當(dāng)歸揮發(fā)油的主要成分為苯酞類，其中藁本內(nèi)酯含量最高[1]，藁本內(nèi)酯有很強(qiáng)的解痙、平喘、鎮(zhèn)定作用，臨床上可用于治療支氣管炎和婦科疾病。研究顯示，藁本內(nèi)酯具有良好的改善微循環(huán)作用，可用于防治與微循環(huán)障礙有關(guān)的疾病[2-3]。與當(dāng)歸腹痛寧滴丸功能主治相吻合，因此當(dāng)歸腹痛寧滴丸的質(zhì)量控制需定量測(cè)定藁本內(nèi)酯的含量，確保藥物的有效性。當(dāng)歸揮發(fā)油是當(dāng)歸經(jīng)水蒸氣蒸餾，再經(jīng)二氯甲烷萃取而得到的，當(dāng)歸腹痛寧滴丸中有可能存在二氯甲烷溶劑殘留，所以需要建立二氯甲烷溶劑殘留檢查項(xiàng)，確保藥物的安全性。在驗(yàn)證原標(biāo)準(zhǔn)時(shí)還發(fā)現(xiàn)原標(biāo)準(zhǔn)中收載的當(dāng)歸薄層鑒別方法[4]，由于展開系統(tǒng)極性太小且點(diǎn)樣量過(guò)大，因此修改了當(dāng)歸薄層鑒別項(xiàng)。

1 材料

1.1 儀器 薄層色譜自動(dòng)點(diǎn)樣儀（CAMAG 半自動(dòng)點(diǎn)樣儀）;薄層自動(dòng)成像儀（CAMAG TLC成像儀）;Agilent 7890A（CTC頂空進(jìn)樣器）氣相色譜儀;Sartorius天平;電子天平（ME-204）;Waters ALLiance e2695 型高效液相色譜儀;e2695 HPLC Pump、2998 DuaLλ Absorbance Detector 和Empower色譜工作站;資生堂CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，島津Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱和Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱; KH-500DE超聲波清洗器（上海超聲波儀器廠）。

1.2 試藥 當(dāng)歸對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：120927-201014）;藁本內(nèi)酯（上海源葉生物科技有限公司提供，批號(hào)：Z23M7B15162，含量：98%）;N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇與乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純;當(dāng)歸腹痛寧滴丸[JP3]（蘭州和盛堂制藥有限公司提供，批號(hào)：20150401、20150402、20150403、20150406、20150407、20150408、20150409、20150701、20150702、20150703）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別 原標(biāo)準(zhǔn)中的當(dāng)歸薄層鑒別方法，由于展開系統(tǒng)極性太小，未將對(duì)照藥材與樣品中相應(yīng)的斑點(diǎn)最大程度的展開（如圖1A所示），所以調(diào)整展開系統(tǒng)的極性（如圖1B所示）。另外，原標(biāo)準(zhǔn)中點(diǎn)樣量過(guò)大，因此調(diào)整點(diǎn)樣量。最終的方法改為：取本品20粒，置乳缽中，加乙醚研磨提取2次，每次10 mL，過(guò)濾，揮干乙醚，殘?jiān)右掖? mL溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材0.5 g，加乙醚5 mL，振搖2 min，分取乙醚液，揮去乙醚，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015年版四部 通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙醚（7∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)。

2.2 二氯甲烷溶劑殘留[5-7]

2.2.1 氣相色譜條件 以6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷為固定相的毛細(xì)管柱（DB-624，柱長(zhǎng)為30 m，內(nèi)徑為0.32 mm，膜厚度為1.8 μm）;柱溫為程序升溫：初始溫度為30 ℃，保持3.5 min，以每分鐘5 ℃的速率升溫至100 ℃，再以每分鐘50 ℃的速率升溫至220 ℃，保持5 min（250 ℃ 后運(yùn)行6 min）;氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)器溫度250 ℃;進(jìn)樣口溫度200 ℃;頂空進(jìn)樣，頂空瓶平衡溫度為90 ℃，平衡時(shí)間30 min，進(jìn)樣體積300 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取二氯甲烷（色譜級(jí)）約30 mg，精密稱定（31.5 mg），加N，N-二甲基甲酰胺稀釋制成每l mL含0.3 mg的溶液，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取重量差異項(xiàng)下的腸溶滴丸，研細(xì)，混勻，取本品約3.0 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，精密加人N，N-二甲基甲酰胺5 mL，密封，振搖使溶散，即得。

2.2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按制備工藝，提取當(dāng)歸藥材的揮發(fā)油，配制不含二氯甲烷的陰性對(duì)照品，并按標(biāo)準(zhǔn)擬定的供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照液，即得。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液以及供試品溶液與對(duì)照品溶液的混合溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性樣品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的出峰時(shí)間未出現(xiàn)相同的峰，且陰性制劑對(duì)所測(cè)組分無(wú)干擾。對(duì)照品溶液中，二氯甲烷的理論塔板數(shù)均大于100000，供試品溶液中二氯甲烷峰及其相鄰色譜峰的色譜分離度均大于1.5，能夠?qū)崿F(xiàn)良好的基線分離。對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液的色譜圖如圖2所示。

2.2.4 線性關(guān)系的考察 取二氯甲烷（色譜級(jí)）約30 mg，精密稱定（31.7 mg），加N，N-二甲基甲酰胺稀釋制成每 mL含0.6 mg的溶液，搖勻，作為線性儲(chǔ)備液備用;分別精密量取線性儲(chǔ)備液體1.0、2.5、4.0、5.0、6.0、7.5 mL置10 mL量瓶中，N，N-二甲基甲酰胺定容，搖勻，分別測(cè)定分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸處理，得到二氯甲烷的回歸方程為Y=94.818X+1.9965（R=0.999），結(jié)果表明，二氯甲烷在 0.0634～0.4755 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液5 mL，置20 mL頂空瓶中，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果二氯甲烷的RSD為2.6%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 檢出限及定量限試驗(yàn) 將線性項(xiàng)下溶液圖譜進(jìn)行計(jì)算信噪比為10的為定量限，信噪比為3的為檢出限之間。結(jié)果二氯甲烷的檢出限為3.1500 μg/mL，定量限為12.6000 μg/mL。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在0、2、4、8、12、16 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果均未檢出，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取2.2.4項(xiàng)下線性儲(chǔ)備液適量，每三份一組，第一組加入線性儲(chǔ)備液5.0 mL;第二組加入線性儲(chǔ)備液10.0 mL;第三組加入線性儲(chǔ)備液15.0 mL，分別置20 mL量瓶中用2.2.2項(xiàng)下的陰性樣品溶液溶解并稀釋至刻度，按供試品溶液制備方法制備，測(cè)定，計(jì)算回收率。[JP2]二氯甲烷的平均加樣回收率為97.7%，RSD為2.2%n=9），本方法回收率良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.9 樣品測(cè)定 取10批樣品（批號(hào)20150401、20150402、20150403、20150406、20150407、20150408、20150409、20150701、20150702、20150703），按“ 2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄測(cè)定結(jié)果。10批樣品均未檢出二氯甲烷溶劑殘留。

2.3 藁本內(nèi)酯的含量測(cè)定[8-10]

2.3.1 色譜條件 色譜柱選用資生堂CAPCELL PAK C18 （5μm，4.6 mm ×250 mm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-乙腈-水 （15∶35∶50）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為327nm，柱溫30 ℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 供試品溶液的制備 取供試品，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入甲醇約40 mL，超聲提取15 min（功率500 W，頻率40 kHz），放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含藁本內(nèi)酯50 μg，即得。

2.3.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例及制備工藝，配制不含當(dāng)歸油的陰性樣品，并按標(biāo)準(zhǔn)擬定的供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照液。

2.3.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的出峰時(shí)間出相同的峰，且陰性樣品溶液所測(cè)組分無(wú)干擾。供試品溶液中，藁本內(nèi)酯的理論塔板數(shù)均大于10000，目標(biāo)色譜峰及其相鄰色譜峰的色譜分離度均大于1.5，能夠?qū)崿F(xiàn)良好的基線分離。對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液的色譜圖如圖3所示。

2.3.4 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取“2.3.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液 2、5、10、15、20、30、40 μL注入高效液相色譜儀，在“2.3.1”條件下測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量X， μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到藁本內(nèi)酯回歸方程為：Y=2760000X+3640，R=0.999999;線性范圍為0.1064～2.1290 μg。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。按峰面積計(jì)算，結(jié)果藁本內(nèi)酯RSD為0.8%n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的當(dāng)歸腹痛寧滴丸樣品6份（批號(hào)20150703），按“2.3.2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，各吸取10 μL進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果藁本內(nèi)酯含量的 RSD為1.8% n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

[JP3]2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（批號(hào)20150703）溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下條件分別在0、4、12、24、48、96 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果藁本內(nèi)酯的RSD為1.2%n=6），表明供試品溶液在96 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取當(dāng)歸腹痛寧滴丸（ 批號(hào) 20150703） 9 份，每份0.25 g，分為3 組。按供試品中待測(cè)化合物含量的50%，100% 和150% 分別加入對(duì)照品溶液（0.1330644 mg/mL、0.443548 mg/mL），按“2.3.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算藁本內(nèi)酯的平均回收率為98.0%，RSD 為2.6%，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.9 樣品測(cè)定 取10批樣品[JP3]（批號(hào)20150401、20150402、20150403、20150406、20150407、20150408、20150409、20150701、20150702、20150703），每批2份，按“ 2.3.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)定含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.10 耐用性試驗(yàn)（不同色譜柱的影響） 為了考察該含量測(cè)定方法的耐用性，實(shí)驗(yàn)分別采用不同和品牌的色譜柱分別測(cè)定樣品（批號(hào)：20150703）的同一供試品溶液，RSD為1.1%，說(shuō)明不同色譜柱對(duì)其結(jié)果的影響較小。見(jiàn)表4。

3 討論

在藁本內(nèi)酯的含量測(cè)定中，分別對(duì)以下四種流動(dòng)相進(jìn)行了考察：1.甲醇-水2.甲醇-1%醋酸溶液;3.乙腈-水;4.甲醇-乙腈-水。流動(dòng)相1、2和3均不符合系統(tǒng)適用性要求，1和2不能使藁本內(nèi)酯峰與其左側(cè)峰的分離度達(dá)到要求，3不能使藁本內(nèi)酯峰與其右側(cè)峰的分離度達(dá)到要求，最后使用三相系統(tǒng)達(dá)到了色譜峰的很好分離，繼續(xù)調(diào)整流動(dòng)相比例，調(diào)整為甲醇-乙腈-水（15∶35∶50），保證主峰出峰時(shí)間盡量小的前提下，使主峰達(dá)到完全分離。對(duì)一批樣品（20150409）分別采用甲醇、乙酸乙酯與三氯甲烷進(jìn)行提取，三種溶劑的提取效率相似，但考慮到環(huán)保，所以采用甲醇為提取溶劑。

二氯甲烷溶劑殘留檢查項(xiàng)色譜條件的選擇中：比較了不同色譜柱， 如HP-5、Rxi-17和DB-624等， 結(jié)果有的樣品中有雜峰干擾， 有的二氯甲烷與相鄰的峰分離， 最終選擇DB-624（30 m×0.320 mm 1.80 μm） 為分析柱， 并對(duì)不同起始柱溫和保持時(shí)間 （70 ℃ 7 min、50 ℃ 5 min和30 ℃ 3.5 min） 進(jìn)行了比較 （后續(xù)升溫速度和保持時(shí)間均相同）， 結(jié)果在30℃ 3.5 min的起始溫度條件下， 目標(biāo)峰得到基線分離。依據(jù)中國(guó)藥典2015年版規(guī)定，二氯甲烷限量為0.06%。實(shí)際樣品中檢測(cè)到的二氯甲烷殘留量均遠(yuǎn)在藥典規(guī)定的限量以下。方法學(xué)研究結(jié)果顯示本法具有足夠的靈敏度， 可檢出樣品中二氯甲烷的含量分別0.0008%。表明本法能有效控制當(dāng)歸腹痛寧滴丸原料藥中殘留溶劑量。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法和高效液相色譜法對(duì)當(dāng)歸腹痛寧滴丸分別進(jìn)行了定性和定量鑒別，采用氣相色譜法建立二氯甲烷溶劑殘留的檢查項(xiàng)。本方法專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于當(dāng)歸腹痛寧滴丸的質(zhì)量控制，為臨床安全科學(xué)用藥提供了指導(dǎo)。

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（收稿日期：2020-05-26 編輯：程鵬飛）

基金項(xiàng)目：甘肅省食品藥品科研項(xiàng)目“替代對(duì)照品法研究當(dāng)歸系列品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”（青年科技創(chuàng)新2018GSFDA058）。

作者簡(jiǎn)介：朱琳（1985-），女，漢族，碩士，主管藥師，研究方向?yàn)樗幬锓治雠c質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：zhupeizhulin@163.com