劉會 鄭文瑤 孫小雯 鄭之明

摘要 ? ?黑曲霉作為一種絲狀真菌，其發(fā)酵過程中的菌絲形態(tài)對檸檬酸產(chǎn)量影響巨大。本文通過調(diào)控接種孢子濃度和搖床轉(zhuǎn)速，對黑曲霉菌球形態(tài)和檸檬酸產(chǎn)量的相關(guān)性進行了研究。結(jié)果表明，菌球直徑和致密度是至關(guān)重要的形態(tài)參數(shù)，將其控制在合適范圍可顯著提高檸檬酸產(chǎn)量。本研究為檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)中黑曲霉菌株的代謝改造和過程調(diào)控提供了參考。

關(guān)鍵詞 ? ?檸檬酸;黑曲霉;菌球形態(tài);接種量;產(chǎn)量;相關(guān)性

中圖分類號 ? ?TQ921+.1 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）20-0201-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）

檸檬酸作為全世界需求量最大的有機酸之一，廣泛用于食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)[1]。黑曲霉是檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)的主要菌種。作為一種絲狀真菌，其發(fā)酵過程中的菌絲形態(tài)可呈現(xiàn)出離散菌絲、菌絲團和菌球3種截然不同的狀態(tài)。大量研究表明，菌絲體形態(tài)是改變發(fā)酵液流變學(xué)性質(zhì)并最終影響代謝產(chǎn)物合成的核心因素，對細胞代謝、發(fā)酵過程、產(chǎn)物積累及后續(xù)的分離提取均有顯著影響[2-3]。因此，本文通過調(diào)控檸檬酸發(fā)酵中的初始接種孢子濃度和搖床轉(zhuǎn)速，開展了黑曲霉菌球形態(tài)與檸檬酸發(fā)酵的相關(guān)性研究，以期為實際生產(chǎn)提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

1.1.1 ? ?供試菌株。黑曲霉chsC-3，由中國科學(xué)院強磁場與離子束物理生物學(xué)重點實驗室保存。

1.1.2 ? ?產(chǎn)孢培養(yǎng)基。采用馬鈴薯（PDA）培養(yǎng)基。取300 g馬鈴薯去皮，稱取200 g切成小塊或削成片后放入鍋中，加入1 000 mL水，煮沸后維持20～30 min。趁熱用2層紗布過濾，棄濾渣。取濾液補水至1 000 mL，加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂，加熱溶化，趁熱分裝，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.3 ? ?發(fā)酵培養(yǎng)基。采用玉米液化清液[4]。取200 g過60目篩的玉米粉，加入1 000 mL水，攪拌加熱至60 ℃加入耐高溫α-淀粉酶，90 ℃保溫液化2 h，碘試呈棕色后液化結(jié)束。經(jīng)110目濾布過濾后加入葡萄糖，使總糖濃度約17%。分裝后，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 ? ?試驗方法

將實驗室保存的黑曲霉chsC-3菌株接種在含產(chǎn)孢培養(yǎng)基的試管斜面上，在36.5 ℃條件下培養(yǎng)7 d。刮取一定量的孢子置于含玻璃珠的無菌水中，旋轉(zhuǎn)振蕩將孢子打散，3層紗布過濾，制備成孢子懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)。分別以5×103、5×104、5×105、5×106、5×107、5×108個/mL的濃度接種到含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速選取150、180、210、240、270、300 r/min 6個條件，36.5 ℃條件下培養(yǎng)3 d。

1.3 ? ?測定指標

使用Olympus TH4-200顯微成像系統(tǒng)獲取菌絲圖像（放大100倍）。利用ImageJ軟件對菌絲顯微圖像進行處理和分析，獲得菌球直徑、菌球核心面積和菌球投影面積等形態(tài)學(xué)參數(shù)。菌球致密度由核心面積除以投影面積的比值決定?？偹岷客ㄟ^斐林試劑法進行檢測。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?接種量對菌球形態(tài)的影響

孢子接種量對發(fā)酵過程中的黑曲霉菌體形態(tài)影響顯著。當接種量高于5×107個/mL時，黑曲霉菌體形態(tài)以離散菌絲或者纏繞的菌絲團為主，無法正常結(jié)球，致密度較低，發(fā)酵液黏度較大;當接種量為5×103～5×106個/mL時，黑曲霉發(fā)酵過程中的菌體均以菌球形態(tài)存在，且菌球直徑與孢子濃度成負相關(guān)。當接種量為5×103個/mL時，菌球直徑較大，致密度很高且菌球數(shù)目相對較少，究其原因可能是孢子碰撞形成晶核的概率受到孢子濃度的影響，接種量越小，孢子碰撞的概率也就越小，形成的晶核較少，菌球數(shù)目較少。當增大到5×104個/mL時，菌球直徑變小，小于100 nm，形成晶核的概率增大，晶核數(shù)目明顯增多，形成的菌球數(shù)目也明顯增加。當接種量為5×105～5×106個/mL時，菌球直徑進一步減小，致密度有所增加。

2.2 ? ?接種量對檸檬酸產(chǎn)量的影響

孢子接種量對檸檬酸產(chǎn)量的影響非常大。當接種量為5×103～5×108個/mL時，檸檬酸產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當接種量低于5×104個/mL時檸檬酸產(chǎn)量逐漸上升，進一步提高接種量，產(chǎn)酸降低;當接種量達到5×107個/mL時，產(chǎn)酸劇烈下降;當接種量繼續(xù)增高至5×108個/mL時，產(chǎn)酸可忽略不計。

2.3 ? ?不同接種量下菌球形態(tài)與檸檬酸產(chǎn)量的相關(guān)性

從以上結(jié)果可以看出，孢子接種量對發(fā)酵過程中黑曲霉菌絲形態(tài)和最終的檸檬酸產(chǎn)量的影響巨大。以此為基礎(chǔ)，進一步對菌球形態(tài)和檸檬酸產(chǎn)量的相關(guān)性進行分析。當接種量為5×103個/mL時，形成的黑曲霉菌球直徑過大且非常致密，菌球內(nèi)部細胞會受到擠壓而導(dǎo)致分子擴散不能自由進行，菌球的中心區(qū)域會發(fā)生細胞自溶而變成空心，影響檸檬酸合成;當接種量增大到5×104個/mL時，菌球直徑小于100 nm，且致密度適中，利于菌球內(nèi)部及菌球和外部環(huán)境間氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸，是最利于產(chǎn)生檸檬酸的形態(tài);當接種量繼續(xù)增大時，雖然菌球直徑仍然較小，但致密度有所增長，影響菌球內(nèi)部的氧氣和營養(yǎng)傳輸，產(chǎn)酸有所下降;當接種量高于5×107個/mL時，以離散菌絲或者菌絲團為主，發(fā)酵液黏度過大嚴重阻礙氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，抑制檸檬酸合成。

2.4 ? ?不同搖床轉(zhuǎn)速對菌球形態(tài)和檸檬酸產(chǎn)量的影響

黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的過程是非常耗氧的，轉(zhuǎn)速的變化不僅能夠影響發(fā)酵液的溶氧，還會影響發(fā)酵液的混合效果及傳能傳質(zhì)，另外還會對發(fā)酵過程中菌球的形成及形態(tài)產(chǎn)生影響。本研究選取150、180、210、240、270、300 r/min 6個搖床轉(zhuǎn)速條件，通過研究不同轉(zhuǎn)速對菌球形態(tài)和檸檬酸產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)檸檬酸產(chǎn)量隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高而不斷增加，試驗允許可設(shè)置的最高轉(zhuǎn)速（300 r/min）最利于檸檬酸的積累，而且轉(zhuǎn)速越高，形成的菌球數(shù)目增多，菌球直徑變小，致密度增大。高轉(zhuǎn)速不僅可以滿足檸檬酸發(fā)酵過程對溶氧的需求，促進菌體生長，而且轉(zhuǎn)速提高未對菌球造成可見的機械損傷，菌絲碎片少，菌球完整且較光滑。究其原因可能是高轉(zhuǎn)速產(chǎn)生了大剪切力，切除了菌球邊緣突出菌絲，限制了菌球的增大并使菌球纏繞致密[5]，進而利于菌球內(nèi)部及菌球與發(fā)酵液之間的傳質(zhì)傳氧，促進檸檬酸積累。在工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速范圍廣，可以達到較高轉(zhuǎn)速。因此，可以綜合考慮成本等因素，通過將發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速提高到合理范圍來獲得有利的菌球形態(tài)，從而促進檸檬酸合成。

3 ? ?結(jié)論與討論

目前，我國檸檬酸年產(chǎn)量約200萬t，占全世界總產(chǎn)量的60%以上，是世界第一的檸檬酸生產(chǎn)和出口國。近年來，隨著檸檬酸在新型產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域如金屬清潔劑與無毒增塑劑等領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用，其全球市場需求量逐年增長（平均每年遞增5%），從而導(dǎo)致提高檸檬酸生產(chǎn)效率成為一種迫切需求。檸檬酸的工業(yè)生產(chǎn)菌——黑曲霉作為一種典型的絲狀真菌，影響其生產(chǎn)效率的因素有很多，菌絲體形態(tài)是其中最有效的參數(shù)之一，對發(fā)酵液的流變學(xué)性質(zhì)及發(fā)酵過程中的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸有重大影響。本研究對黑曲霉菌球形態(tài)和檸檬酸產(chǎn)量之間的相關(guān)性進行了探討，發(fā)現(xiàn)在黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的過程中，菌絲體形態(tài)對檸檬酸產(chǎn)率有非常重要的影響，其中菌球直徑和致密度是至關(guān)重要的形態(tài)參數(shù)，將其控制在合適范圍內(nèi)可顯著提高檸檬酸產(chǎn)量。當菌絲體離散生長時，發(fā)酵液黏度增加，限制了營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣在發(fā)酵液中的傳遞，不利于菌體生長和檸檬酸的積累;如果形成的菌球直徑較大且致密度過高，菌球內(nèi)部不易與外部培養(yǎng)液交換營養(yǎng)和氧氣，同樣會降低檸檬酸產(chǎn)率。綜上所述，本研究為檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)中黑曲霉菌株的代謝改造[6]和過程調(diào)控提供了參考。

4 ? ?參考文獻

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