董曉柳 宋麗華 董偉 高銘 張秀清 劉蔚然 徐士軍 劉鐵軍 崔璐莎

摘 要 目的：通過(guò)右美托咪定（Dex）對(duì)膿毒癥模型大鼠腦損傷中沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）/蛋白激酶B（Akt）/糖原合酶激酶3β（GSK3β）/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路的影響，探究其對(duì)腦損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法：選取雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、膿毒癥組（CLP組）、CLP+Dex組（10 μg/kg Dex）、CLP+Dex+Sirtinol組（10 μg/kg Dex+2 μL/100 g SIRT1抑制劑Sirtinol），每組20只。造模前2 h，CLP+Dex+Sirtinol組大鼠經(jīng)側(cè)腦室注射給予Sirtinol;各組大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥模型（Sham組僅手術(shù)但不結(jié)扎穿孔）。造模結(jié)束后0、3、6 h，CLP+Dex組、CLP+Dex+Sirtinol組大鼠分別腹腔注射Dex（10 μg/kg），Sham組和CLP組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。末次給藥24 h后，檢測(cè)大鼠腦組織含水量、伊文思藍(lán)（EB）含量、大腦皮層組織細(xì)胞凋亡情況和腦組織中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達(dá)水平，以及海馬組織中SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與Sham組比較，CLP組大鼠腦組織含水量、EB含量、大腦皮層組織凋亡細(xì)胞數(shù)及腦組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平顯著增加或升高（P<0.05）;海馬組織SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與CLP組比較，CLP+Dex組大鼠腦組織含水量、EB含量、大腦皮層組織凋亡細(xì)胞數(shù)及腦組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平顯著減少或降低（P<0.05）;海馬組織中SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。而Sirtinol可顯著逆轉(zhuǎn)Dex的上述腦保護(hù)和因子調(diào)節(jié)作用（P<0.05）。結(jié)論：Dex對(duì)膿毒癥模型大鼠具有腦保護(hù)作用，該作用可能是通過(guò)激活SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路而發(fā)揮抗炎、抗凋亡等作用，從而減輕腦水腫、保護(hù)血腦屏障并減輕腦損傷。

關(guān)鍵詞 右美托咪定;膿毒癥;腦損傷;腦保護(hù)作用;SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路;炎癥反應(yīng);機(jī)制;大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of dexmedetomidine （Dex） on SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin signaling pathway in cerebral injury of sepsis model rats， and explore the mechanism of its protecitve effect on cerebral injury. METHODS： A total of 80 male SD rats were randomly divided into sham operation group （Sham group）， sepsis group （CLP group）， CLP+Dex group （10 μg/kg Dex）， CLP+Dex+Sirtinol group （10 μg/kg Dex+2 μL/100 g SIRT1 inhibitor sirtinol）， with 20 mice in each group. Two hours before modeling， CLP+Dex+Sirtinol group was injected with sirtinol via lateral ventricle. Sepsis model was induced by cecal ligation and perforation in each group （in sham group， only operation was performed but no ligation was performed）. At 0， 3， 6 h after modeling， CLP+Dex group and CLP+Dex+Sirtinol group were given Dex （10 μg/kg） intraperitoneally， Sham group and CLP group were given constant volume of normal saline intraperitoneally. Cerebral tissue water content， Evans blue （EB） content， apoptosis in cerebral cortex， the levels of IL-1β and TNF-α in cerebral tissue as well as the protein expression of SIRT1， p-Akt， p-GSK3β and β-catenin in hippocampus were detected 24 h after last medication. RESULTS： Compared with Sham group， cerebral tissue water content， EB content， the number of apoptotic cells in cerebral cortex as well as the levels of IL-1β and TNF-α in cerebral tissue were increased significantly （P<0.05）， while the protein expression of SIRT1， p-Akt， p-GSK3β and β-catenin in hippocampus were decreased significantly （P<0.05）. Compared with CLP group， cerebral tissue water content， EB content， the number of apoptotic cells in cerebral cortex as well as the levels of IL-1β and TNF-α in cerebral tissue were decreased significantly in CLP+Dex group （P<0.05）， while the protein expression of SIRT1， p-Akt， p-GSK3β and β-catenin in hippocampus were increased significantly （P<0.05）. Sirtinol could significantly reverse the above-mentioned cerebral protection and factor regulation effects of Dex （P<0.05）. CONCLUSIONS： Dex can protect the cerebral tissue of sepsis model rats， which may play an anti-inflammatory and anti-apoptotic role by activating SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin signaling pathway， so as to reduce cerebral edema， protect blood-brain barrier and reduce cerebral injury.

KEYWORDS Dexmedetomidine; Sepsis; Cerebral injury; Brain protection effect; SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin signaling pathway; Inflammation reaction; Mechanism; Rats

膿毒癥是各種感染、重度燒創(chuàng)傷、休克及外科大手術(shù)后臨床重癥患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，是感染誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征[1]。膿毒癥伴腦功能障礙是膿毒癥患者死亡率上升的重要原因[2]。右美托咪定（Dexmedetomidine，Dex）是一種新型高選擇性α2受體激動(dòng)劑，其可通過(guò)血腦屏障，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用且不引起呼吸抑制，已被廣泛應(yīng)用于術(shù)前鎮(zhèn)靜用藥、術(shù)中全身麻醉輔助用藥、術(shù)后鎮(zhèn)痛等領(lǐng)域[3]。研究表明，Dex對(duì)膿毒血癥模型大鼠有保護(hù)作用，但其發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制目前尚不完全清楚[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silent information regulator 1，SIRT1）是一種具有組蛋白脫乙酰化酶活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，已有研究報(bào)道，SIRT1的激活在腦缺血再灌注損傷[5]、蛛網(wǎng)膜下腔出血[6]、膿毒癥腦病[7]等多種腦部疾病中發(fā)揮了明確的腦保護(hù)作用。SIRT1過(guò)表達(dá)可以增加蛋白激酶B（Akt）的活性[8]，而Akt是維持細(xì)胞存活的關(guān)鍵激酶。且有研究表明，糖原合酶激酶3（GSK3β）/β連環(huán)蛋白（β-catenin）通路受Akt的調(diào)控[9]。然而，Dex對(duì)膿毒癥腦保護(hù)作用是否通過(guò)SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin通路發(fā)揮作用目前尚不明確。Sirtinol是一種高效的去乙?；福⊿irtuin）抑制劑，Grozinger CM等[10]發(fā)現(xiàn)在體外細(xì)胞中Sirtinol能夠抑制SIRT1的表達(dá)。因此，本研究旨在通過(guò)考察Dex及Sirtinol的干預(yù)對(duì)膿毒癥模型大鼠腦損傷中SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路的影響，來(lái)探討Dex對(duì)膿毒癥模型大鼠腦保護(hù)的作用機(jī)制，為臨床用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

68526型立體定位儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司）;KDS100型注射泵（美國(guó)KD Scientific公司）;701RN型微量注射器（瑞士Hamilton公司）;4-15C型常溫離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）;CM1900型冰凍切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）;RL157252型免疫熒光顯微鏡（河北潤(rùn)創(chuàng)科技開(kāi)發(fā)有限公司）;Tissuelyser-192型組織勻漿儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）;H·SWX-600BS型恒溫水浴箱（濟(jì)寧市翰業(yè)機(jī)械設(shè)備有限公司）;125-0143型酶標(biāo)儀、12003153型凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 藥物與試劑

注射用Dex（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20041631，規(guī)格：2 mL ∶ 0.2 mg）;SIRT1抑制劑Sirtinol（美國(guó)Selleck公司，批號(hào)：S280401，純度：>97%）;戊巴比妥鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20090505）;磷酸鹽緩沖液（PBS，碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：CO221A）;伊文思藍(lán)（EB，批號(hào)：C195555）、原位末端標(biāo)記（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：T2190-50T）、丙烯酰胺（批號(hào)：A8080-Amrecso）、過(guò)硫酸銨（批號(hào)：A8090）、二甲基甲酰胺（批號(hào)：D4670）、Triton-X100（批號(hào)：T8200）、BCA試劑盒（批號(hào)：PC0020）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：D8370）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：ab197742）、鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：ab208348）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;PVDF膜（北京沃比森科技有限公司）;兔p-Akt多克隆抗體（批號(hào)：4060）、兔p-GSK3β多克隆抗體（批號(hào)：9323）、兔β-catenin多克隆抗體（批號(hào)：9582）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;兔SIRT1多克隆抗體（批號(hào)：ab189494）、兔神經(jīng)元核抗原（NeuN）多克隆抗體（批號(hào)：ab177487）、內(nèi)參β-actin（批號(hào)：ab8226）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;綠色熒光二抗（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：A32731）;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)公司，批號(hào)：ZB-2301）。

1.3 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008]。動(dòng)物由華北理工大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行專(zhuān)人飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為安靜、通風(fēng)、清潔、晝夜室溫22～25 ℃、相對(duì)濕度40%～55%、自然光線(xiàn)12 h/12 h晝夜交替照明。大鼠實(shí)驗(yàn)前分籠飼養(yǎng)1周，以適應(yīng)環(huán)境。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將80只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、膿毒癥組（CLP組）、CLP+Dex組（10 μg/kg Dex）、CLP+Dex+Sirtinol組（10 μg/kg Dex+2 μL/100 g Sirtinol），每組20只。采用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法構(gòu)建膿毒癥大鼠模型[11]：大鼠術(shù)前一晚禁食，次日用2%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，腹部消毒后，于其腹正中切開(kāi)約1.5 cm切口，找出盲腸，結(jié)扎回盲瓣遠(yuǎn)端盲腸，用無(wú)菌注射器針頭在結(jié)扎處與盲腸末端中點(diǎn)處做2次貫通穿孔，擠出腸內(nèi)容物后，將盲腸連同擠出的腸內(nèi)容物一同回納腹腔，縫合切口。Sham組大鼠進(jìn)行同樣實(shí)驗(yàn)操作，但不結(jié)扎穿孔盲腸。

CLP+Dex+Sirtinol組大鼠于造模前2 h經(jīng)側(cè)腦室注射抑制劑Sirtinol，具體操作方法[12]如下：采用2%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）腹腔注射將大鼠麻醉，將其固定在腦立體定位儀上，以75%乙醇消毒后暴露顱骨和前囟的位置，將前囟作為中心點(diǎn)，向右側(cè)旁開(kāi)1.0 mm，向后面開(kāi)1.6 mm，用小顱鉆磨1個(gè)骨孔，在骨孔處將微量注射器垂直進(jìn)入深度約3.6 mm處，以0.5 μL/min的速度注射Sirtinol（劑量為2 μL/100 g;以0.5% DMSO溶液配成濃度為2 mmol/L的溶液，于4 ℃保存，使用前加熱至37 ℃使其成透明水樣物）[13]。注射完畢，將注射器停留約5 min，隨后注射器每向上拔出1 mm停留5 min，完全拔出后用骨蠟將骨孔封閉。處理大鼠手術(shù)傷口，麻醉未醒前給予電熱毯保暖。

造模結(jié)束0、3、6 h后，CLP+Dex組、CLP+Dex+Sirtinol組大鼠分別腹腔注射Dex（劑量為10 μg/kg）[13]，Sham組、CLP組大鼠同法注射等體積的生理鹽水。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 大鼠腦組織含水量 采用經(jīng)典干濕質(zhì)量法進(jìn)行檢測(cè)。末次給藥24 h后，各組分別取4只大鼠，采用頸椎脫臼法處死，立即斷頭取新鮮腦組織，自中線(xiàn)將大腦切割成左半球和右半球組織，并分離出小腦組織。稱(chēng)量上述3個(gè)部分腦組織的濕質(zhì)量并記錄;然后用錫紙包裹好上述腦組織，迅速置于100 ℃的烘箱中烘烤24 h后再稱(chēng)量，直至恒質(zhì)量，此時(shí)稱(chēng)得的質(zhì)量即為干質(zhì)量。按公式計(jì)算腦組織含水量：腦組織含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。腦組織含水量越高，則表示大鼠腦水腫越嚴(yán)重。

2.2.2 血腦屏障滲漏程度 采用EB示蹤劑進(jìn)行檢測(cè)。末次給藥24 h后，各組分別取4只大鼠，于尾靜脈注射2%EB溶液（2 mL/kg）為示蹤劑。注射后，可見(jiàn)大鼠如鞏膜、耳廓、前后爪墊等部位迅速變?yōu)樗{(lán)色，提示注射成功。2 h后，將大鼠麻醉并處死，使用預(yù)冷的PBS進(jìn)行心臟灌注[具體方法：用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）深度麻醉大鼠后，開(kāi)胸、暴露心臟及主動(dòng)脈，將鈍針經(jīng)心尖處插入左心室直至主動(dòng)脈起始部，并在右心耳剪一小口，將PBS從輸液管滴入大鼠體循環(huán)，先快后慢，持續(xù)5～10 min（滴注體積為200 mL）]，確保將大鼠腦內(nèi)血液盡量排出。灌注成功（當(dāng)大鼠右心耳流出的液體基本無(wú)色，肝變白、變硬，尾巴變直，四肢抽搐，表明灌注成功）后，將大鼠斷頭取腦，去掉嗅球及小腦，稱(chēng)量大腦半球濕質(zhì)量，放入10 mL組織研磨管中，同時(shí)往其中加入5 mL二甲基甲酰胺，應(yīng)用組織勻漿儀將腦組織勻漿，然后轉(zhuǎn)移至15 mL試管中，并將試管于60 ℃恒溫水浴中孵育72 h。孵育結(jié)束后，以1 000 r/min離心5 min，棄去沉淀，取上清液，采用分光光度計(jì)于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各樣本及標(biāo)準(zhǔn)品光密度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度（80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 μg/mL），利用Excel表計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（y=ax+b），再根據(jù)各樣本測(cè)得的OD值，代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式，計(jì)算出樣本EB濃度;再根據(jù)公式計(jì)算大鼠腦組織中EB含量：EB含量（μg/g）=EB濃度（μg/mL）×二甲基甲酰胺體積（mL）/腦濕質(zhì)量（g）。大鼠腦組織中EB含量越高，表示血腦屏障滲漏程度越嚴(yán)重。

2.2.3 大鼠大腦皮層組織細(xì)胞凋亡情況 采用TUNEL/NeuN免疫熒光雙標(biāo)染色法進(jìn)行檢測(cè)。末次給藥24 h后，各組分別取4只大鼠，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處死后進(jìn)行心臟灌注，灌注成功后，大鼠斷頭取腦，冰凍后切片（厚度：8 μm），再采用0.3% Triton-X100打孔破膜，室溫封閉，用PBS清洗5 min×3次，滴加NeuN一抗（稀釋度為 ?1 ∶ 500），4 ℃孵育過(guò)夜;將預(yù)先混合好的TUNEL反應(yīng)液中加入綠光熒光二抗，滴加在玻片上（40 μL/片），于37 ℃下濕盒內(nèi)避光孵育2 h;用PBS清洗5 min×3次，封片，在熒光顯微鏡下觀察。在大腦皮層區(qū)域隨機(jī)選取6個(gè)視野拍照，使用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)每張圖片的熒光強(qiáng)度和腦細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行半定量分析。以TUNEL染色陽(yáng)性（鏡下顯紅色熒光，表示凋亡細(xì)胞核）和NeuN染色陽(yáng)性（鏡下顯綠色熒光，表示神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)）反映細(xì)胞凋亡情況（兩者重疊處即為凋亡細(xì)胞），計(jì)算每個(gè)視野的凋亡細(xì)胞數(shù)量，取平均值（以每mm2凋亡細(xì)胞數(shù)表示）。

2.2.4 大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α水平 采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。末次給藥24 h后，各組分別取4只大鼠，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處死后進(jìn)行心臟灌注，灌注成功后，大鼠斷頭取腦，制成勻漿。按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)IL-1β、TNF-α水平。

2.2.5大鼠海馬組織中SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平 采用Western blotting法進(jìn)行檢測(cè)。末次給藥24 h后，各組分別取4只大鼠，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處死后進(jìn)行心臟灌注，灌注成功后，大鼠斷頭取腦。分離海馬組織，稱(chēng)定質(zhì)量，加入現(xiàn)配的含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，于冰上研磨，充分裂解30 min。將組織勻漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，以12 000 r/min離心5 min，取上清液以BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。取適量蛋白煮沸變性后，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，再以5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin一抗、β-actin內(nèi)參（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過(guò)夜;再用TBST溶液清洗，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗（稀釋度為1 ∶ 2 000），于室溫下孵育1 h;再用TBST溶液清洗，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光液法，在凝膠成像儀中曝光顯影后采用Quantity One 4.4.0軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度值，以β-actin內(nèi)參蛋白光密度值為參照計(jì)算相對(duì)灰度值，表示其表達(dá)水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠腦組織含水量和EB含量比較

與Sham組比較，CLP組、CLP+Dex組 、CLP+Dex+Sirtinol組大鼠腦組織含水量和EB含量均顯著升高（P<0.05）;與CLP組比較，CLP+Dex組大鼠腦組織含水量和EB含量均顯著降低（P<0.05）;與CLP+Dex組比較，CLP+Dex+Sirtinol組大鼠腦組織含水量和EB含量均顯著升高（P<0.05）。各組大鼠腦組織中含水量和EB含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 各組大鼠大腦皮層組織細(xì)胞凋亡情況比較

與Sham組比較，CLP組、CLP+Dex組、CLP+Dex+Sirtinol組大鼠大腦皮層組織凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）;與CLP組比較，CLP+Dex組大鼠大腦皮層組織凋亡細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<0.05）;與CLP+Dex組比較，CLP+Dex+Sirtinol組大鼠大腦皮層組織凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）。各組大鼠大腦皮層組織凋亡細(xì)胞免疫熒光顯微圖見(jiàn)圖1（圖中“合并”表示凋亡細(xì)胞核與神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)的疊加圖），凋亡細(xì)胞數(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 各組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α水平比較

與Sham組比較，CLP組、CLP+Dex組、CLP+Dex+Sirtinol組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α水平均顯著升高（P<0.05）;與CLP組比較，CLP+Dex組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α水平均顯著降低（P<0.05）;與CLP+Dex組比較，CLP+Dex+Sirtinol組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α水平均顯著升高（P<0.05）。各組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

3.4 各組大鼠海馬組織中SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平比較

與Sham組比較，CLP組、CLP+Dex組、CLP+Dex+Sirtinol組大鼠海馬組織中SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）;與CLP組比較，CLP+Dex組大鼠海馬組織中上述蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）;與CLP+Dex組比較，CLP+Dex+Sirtinol組大鼠海馬組織中上述蛋白表達(dá)水平均顯著減低（P<0.05）。各組大鼠海馬組織中SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

4 討論

膿毒癥是感染的宿主因反應(yīng)失調(diào)（即當(dāng)病原體感染后，機(jī)體即啟動(dòng)自身免疫機(jī)制，在清除病原體的同時(shí)，也常常造成自身毛細(xì)血管內(nèi)皮的損傷、毛細(xì)血管的滲漏、凝血功能障礙以及局部炎癥損傷）引起的致命性器官功能障礙性疾病，其病理特點(diǎn)是腦內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接功能障礙，可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)和神經(jīng)毒性介質(zhì)進(jìn)入大腦，造成膿毒癥性腦損傷[14]。在膿毒癥的發(fā)病過(guò)程中，機(jī)體會(huì)釋放大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)[15]，可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙和血腦屏障滲透性的變化[16]。血腦屏障破壞后，大量有害物質(zhì)可進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致腦水腫，誘導(dǎo)腦損傷[17]。腦組織含水量是反映腦水腫程度的重要指標(biāo);另外，在正常情況下，EB與白蛋白結(jié)合，不易透過(guò)血腦屏障，當(dāng)血腦屏障受到破壞時(shí)，EB可大量通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織[2]。因此，腦組織含水量和EB含量均可反映血腦屏障的完整性。IL-1β和TNF-α為細(xì)胞炎性因子，與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)：IL-1β可激發(fā)中樞免疫細(xì)胞釋放大量炎癥因子;TNF-α可介導(dǎo)血腦屏障的開(kāi)放和星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道-4表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致腦水腫，還可激活一氧化氮合酶，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[18]。本研究通過(guò)對(duì)膿毒癥模型大鼠腦組織含水量、血腦屏障滲漏程度（以EB含量顯示）、腦細(xì)胞凋亡情況、腦組織炎癥因子水平等檢測(cè)，來(lái)評(píng)估膿毒血癥后腦損害情況。

目前，Dex被廣泛應(yīng)用于臨床麻醉輔助用藥，研究表明其對(duì)膿毒癥模型大鼠的腦組織具有保護(hù)作用[14]，但其具體機(jī)制尚不完全清楚。SIRT1在哺乳動(dòng)物下丘腦及海馬神經(jīng)元中表達(dá)豐富[19]。研究表明，Dex可通過(guò)SIRT1信號(hào)通路減輕老齡大鼠術(shù)后的認(rèn)知功能障礙[20];且SIRT1過(guò)表達(dá)可使Akt磷酸化水平升高而使其激活[21]。GSK3β是Akt下游靶酶，而β-catenin是GSK3β的下游分子，當(dāng)Akt發(fā)生磷酸化被激活后，其下游分子GSK3β活性受到抑制，此時(shí)β-catenin的磷酸化途徑被阻斷而不能降解，從而導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞內(nèi)大量聚集并進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而可能激活或抑制一些重要的靶基因，來(lái)調(diào)控其他多種基因的表達(dá)[22]。綜上，筆者推測(cè)SIRT1/Akt/GSK3β/ β-catenin信號(hào)通路有可能參與Dex對(duì)膿毒癥模型大鼠的腦組織保護(hù)過(guò)程。

本研究通過(guò)建立大鼠膿毒癥模型，并給予Dex及SIRT1抑制劑等干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，CLP組、CLP+Dex組、CLP+Dex+Sirtinol組大鼠腦組織含水量、EB含量、大腦皮層組織細(xì)胞凋亡數(shù)和腦組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α水平均顯著增加或升高，說(shuō)明膿毒癥可造成大鼠腦組織損害;海馬組織中SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著降低，說(shuō)明SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路的抑制可能參與了膿毒癥模型大鼠腦組織的損傷過(guò)程。與CLP組比較，CLP+Dex組大鼠腦組織含水量、EB含量、大腦皮層組織細(xì)胞凋亡數(shù)和腦組織中IL-1β、TNF-α水平均顯著減少或降低，說(shuō)明Dex可減輕膿毒癥模型大鼠的腦組織損傷;且海馬組織中SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著升高，說(shuō)明其作用機(jī)制可能為：Dex可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入大鼠腦組織，激活SIRT1使其蛋白表達(dá)水平增加，從而使下游Akt磷酸化水平升高而活化，繼而使GSK3β磷酸化水平升高而其活性被抑制，導(dǎo)致β-catenin去磷酸化而被激活，并能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

為反向驗(yàn)證上述腦保護(hù)作用機(jī)制，本研究采用SIRT1抑制劑Sirtinol進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，與CLP+Dex組比較，CLP+Dex+Sirtinol組上述指標(biāo)水平發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步證實(shí)SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路參與了Dex對(duì)膿毒癥模型大鼠腦組織的保護(hù)作用。

綜上所述，Dex對(duì)膿毒癥模型大鼠具有腦保護(hù)作用，該作用可能是通過(guò)激活SIRT1/Akt/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路而發(fā)揮抗炎、抗凋亡等作用，從而減輕腦水腫、保護(hù)血腦屏障并減輕腦損傷。

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（收稿日期：2020-06-13 修回日期：2020-09-30）

（編輯：羅 瑞）