汪旭偉， 馬沛

（河南省南陽市第一人民醫(yī)院 普外一科， 河南 南陽473000）

microRNAs （miRNAs） 是一類在轉(zhuǎn)錄后與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的小分子、 非編碼 RNA［1］。 近年來 miR－21 被證實(shí)在直腸癌、 宮頸癌、 肝癌等癌癥組織中呈異常表達(dá)， 但其具體調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。 研究［2］表明， 我國每年肝癌患者新增超40 萬例， 且發(fā)病率仍逐年上升， 故而進(jìn)一步探尋肝癌組織中 miR－21 的調(diào)控機(jī)制意義重大。 目前已有研究［3］顯示 miR－21 在肝癌組織中呈異常表達(dá)水平， 但針對其異常表達(dá)后對肝癌細(xì)胞的增殖、 轉(zhuǎn)移等癌癥組織的重要生物學(xué)特征仍鮮有報(bào)道?；诖?， 本研究通過觀察肝癌組織、 癌旁組織中miR－21 的表達(dá)水平， 并構(gòu)建低表達(dá)、 高表達(dá)miR－21 肝癌細(xì)胞株， 以期探尋miR－21 對原發(fā)性肝癌細(xì)胞增殖、 轉(zhuǎn)移和侵襲的調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)臨床病情判斷和治療方案制定提供參考， 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取 2014 年 7 月至 2019 年 3 月我院收治的原發(fā)性肝癌患者100 例， 分離其肝癌組織和癌旁組織， 取材后迅速將樣本置于液氮中待測。

1.2 細(xì)胞株和主要試劑

1.2.1 試劑和儀器 Has-miR－21 inhibitor 和 Hsa－miR－21 mimics（Biomics Biotech）， 胰蛋白酶、 DMEM 培養(yǎng)液 （上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）， 胎牛血清 （賽默飛旗下 Gibco）； RNA 提取試劑、 Lipo－2000 轉(zhuǎn)染試劑盒 （賽默飛）， Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （北京綠源伯德）， 低溫離心機(jī) （浙江三聯(lián)環(huán)保科技股份有限公司）， 超低溫冰箱 （廣州傲雪）， UNIVERSAL 320／320R 冷凍離心機(jī) （美國貝克曼）。

1.2.2 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 自事先保存樣本的液氮中取出HepG2 細(xì)胞凍存管， 水浴融化后移至15 mL 離心管中， 隨后離心分離上清液， 在5% CO2、 37 ℃含10%胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 待細(xì)胞株生長密度為90%時進(jìn)行傳代， 首先將洗滌后的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化， 隨后采用4 mL DMEM 培養(yǎng)基中斷細(xì)胞消化， 并采用倒置顯微鏡下觀察， 最后以50%的接種密度將細(xì)胞接種于 6 孔板， 并依據(jù)操作手冊分別采用 Has-miR-21 inhibitor （ 100 nm／L） + Lipofectamine 2000， Hsa -miR -21 mimics （50 nm／L） + Lipofectamine 2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 細(xì)胞增殖檢測采用MTT 法將增強(qiáng)組、 抑制組按每孔 1 ×103個分別接種于96 孔板中。 培養(yǎng) 7 d 后加入MTT 測定液10 μL， 37 ℃孵育 2 h， 隨后采用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長處測定吸光度值， 并計(jì)算肝癌細(xì)胞株增殖情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)， 計(jì)量資料以表示， 行 t 檢驗(yàn)， P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織與癌旁正常組織miR－21 及MAP2K3 表達(dá)水平比較qPCR 檢測結(jié)果顯示， 癌旁正常組織、 肝癌組織的miR-21表達(dá)量分別為 67.86 ± 0.59、 89.63 ± 4.42； 癌旁正常組織、 肝癌組織的 MAP2K3 表達(dá)量分別為 5853.61 ± 271.85、 1396.78 ±97.36； 組間數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.05）。 見圖 1。

圖1 肝癌組織與癌旁正常組織miR－21 及MAP2K3 表達(dá)水平比較

2.2 miR－21 對肝癌HepG2 細(xì)胞株增殖的影響抑制組增殖細(xì)胞數(shù)為 265.73 ± 58.62， 低于增強(qiáng)組的 429.54± 69.35 （P ＜0.05）； 抑制組的遷移細(xì)胞數(shù)為 87.52 ± 19.31。 見圖 2。

圖2 miR－21 對肝癌HepG2 細(xì)胞株增殖、 遷移、 侵襲的影響

3 討論

我國受公共衛(wèi)生水平限制， 丙型肝炎病毒 （HCV） 和乙型肝炎病毒 （HBV） 感染風(fēng)險顯著高于西方國家。 長期 HBV 感染極易導(dǎo)致肝硬化， 進(jìn)而顯著提升肝癌發(fā)病風(fēng)險。 研究［4-5］表明， 肝炎合并肝硬化和HBV 感染為肝癌發(fā)病的獨(dú)立危險因素。既往肝癌診斷多采用甲胎蛋白 （AFP） 作為特異性標(biāo)志物， 但在臨床診斷中發(fā)現(xiàn)異常凝血酶原 （DCP） 和甲胎蛋白異質(zhì)體（AFP-L3） 特異度和靈敏度均較差， 故而在肝癌發(fā)生發(fā)展中尋找更具特異度和靈敏度的血清標(biāo)志物意義重大。

Lin-4 最早被發(fā)現(xiàn)于1993 年， 為最早被發(fā)現(xiàn)的microRNA，在隨后的不斷深入研究中發(fā)現(xiàn)miRNAs 的表達(dá)非常保守， 且僅在特定組織、 特定發(fā)育階段表達(dá)， 故被譽(yù)為基因表達(dá)研究領(lǐng)域中的新里程碑。 迄今已有上百種miRNAs 被發(fā)現(xiàn)， 且已有部分miRNAs 被證實(shí)在癌細(xì)胞的增殖、 遷移、 侵襲中具有獨(dú)特的調(diào)控作用， 其中miR-21 在胰腺癌、 食管癌、 肺癌中呈異常表達(dá)。Zhuang 等［6］發(fā)現(xiàn)在肝癌患者血清中 miR-21 呈異常水平表達(dá)，且結(jié)果顯示AFP 和miRNA 組合的敏感性為87.0%， 這預(yù)示著miR-21 可作為肝癌診斷的高特異性血清標(biāo)志物。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 肝癌組織miR-21 表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織 （P ＜0.05）， 表明與正常組織相比， 原發(fā)性肝癌患者癌癥組織中存在明顯的miR-21 過表達(dá)現(xiàn)象。

既往實(shí)驗(yàn)多針對肝癌患者miR-21 是否過表達(dá)展開討論，而miR-21 對肝癌細(xì)胞有關(guān)的生物學(xué)行為卻鮮有報(bào)道。 在細(xì)胞增殖、 分化過程中MAPK 蛋白家族中的p38 信號途徑尤為重要， 而MAP2K3 又與p38MAPK 信號通路激活存在密不可分的關(guān)系。 本實(shí)驗(yàn)分別轉(zhuǎn)染了Has-miR-21 inhibitor 和Hsa-miR-21 mimics， 結(jié)果顯示抑制組增殖細(xì)胞數(shù)為 265.73 ± 58.62， 顯著低于增強(qiáng)組的 429.54 ± 69.35 （P ＜0.05）， 表明 miR-21 對肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為存在調(diào)控作用。 分析原因在于： 在肝癌HepG2細(xì)胞株中存在miR-21 可直接作用的靶點(diǎn)位 MAP2K33＇UTR，miR-21 可通過與 MAP2K33＇UTR 上僅8 bp 的預(yù)測位點(diǎn)抑制熒光素酶的表達(dá)。 此外本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示， 肝癌組織中MAP2K3的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織 （P ＜0.05）， 表明作為在原發(fā)性肝癌中呈低表達(dá)的MAP2K3 基因可被視為新的抑癌基因，而通過調(diào)控miR-21 的表達(dá)對MAP2K3 存在的負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制為臨床肝癌治療提供了新思路。

綜上所述， 在原發(fā)性肝癌組織中miR-21 呈過表達(dá)， 可通過抑制miR-21 表達(dá)， 進(jìn)而靶向調(diào)節(jié)MAP2K3 表達(dá)水平， 從而降低肝癌細(xì)胞的增殖、 遷移和侵襲。