秦燕飛，孫建平*，任艷文，梁 蒙，陳佳威

（1.中國長城葡萄酒有限公司技術(shù)中心，河北 懷來 075400；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部釀酒葡萄加工重點實驗室，河北 懷來 075400）

2,4,6-三氯苯甲醚（2,4,6-trichloroanisole，TCA）是造成葡萄酒軟木塞污染的主要成分之一，它是由一類生長在軟木塞內(nèi)的霉菌，為了去除其生長環(huán)境中的2,4,6-三氯苯酚，作為一種脫毒機制而產(chǎn)生的物質(zhì)[1-2]。因其具有強烈的泥土和發(fā)霉氣味[3-4]，痕量的TCA便會令人不悅。美國食品藥品監(jiān)督管理局的研究報告表明，消費者對于TCA的閾值水平一般在3.1 ng/L[5]。瓶裝后經(jīng)木塞遷移到葡萄酒中的TCA比葡萄酒本身還穩(wěn)定，而且該過程基本是不可逆的[6-7]，根據(jù)測算，全球每年因TCA污染而造成的葡萄酒損失可達100億美元[8]。

TCA在軟木塞和葡萄酒中的含量都非常低（ng/L水平），因此，高效的前處理萃取技術(shù)和靈敏度極高的檢測方法是必不可少的，應(yīng)用最多的是頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法或氣相色譜-電子捕獲檢測器法[9-10]。目前，國家尚未明確規(guī)定軟木塞中TCA的限量標準，但各葡萄酒企業(yè)對木塞中TCA的限量比較低，基本都在2 ng/L，有些天然塞要求在1 ng/L。通常使用分析結(jié)果作為決策依據(jù)時，必須對結(jié)果的可靠性有所了解[11]。因此，木塞中TCA的遷移量不僅要求檢測準確，而且在限量值附近的結(jié)果可靠。不確定度是對測定結(jié)果的信息補充，反映了測量結(jié)果可信程度的高低；它一方面便于評定結(jié)果的可靠性，另一方面也可增強實驗室間或?qū)嶒炇覂?nèi)部測量結(jié)果間的可比性[12]。

本研究參照中國合格評定國家認可委員會CNASGL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[12]、中華人民共和國國家計量技術(shù)規(guī)范JJF1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[13]及國際標準化組織ISO 20752—2014《cork stoppers—determination of releasable 2,4,6-trichloroanisol（TCA）》[14]，對軟木塞中TCA檢測的不確定度進行評定，旨在為評價測量數(shù)據(jù)的準確性、可靠性提供科學(xué)依據(jù)，并通過分析不確定度的主要影響因素，后期重點把控以確保檢測結(jié)果的準確、可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用軟木塞由某生產(chǎn)廠商提供，每批次取樣40個，密封包裝后備用。

本方法使用符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水；四無乙醇（色譜純）：天津市光復(fù)精細化工研究所；無水乙醇、氯化鈉（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）標品（純度99.5%）、2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）-D5標品（純度98.8%）：Dr.EhrenstorferGmbh公司。固定相為5%二苯基95%二甲基聚硅氧烷共聚物：美國瑞斯泰克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS QP2010Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）裝置；100 μm PDMS SPME萃取頭：上海安譜實驗科技股份有限公司；低極性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

1.3 實驗方法

1.3.1 TCA系列標準溶液配制

準確稱取TCA標品10 mg，用四無乙醇定容至100 mL容量瓶，質(zhì)量濃度為100 mg/L，作為TCA標準儲備液。用12%乙醇溶液逐級稀釋至質(zhì)量濃度為100 ng/L，再分別配制質(zhì)量濃度為20 ng/L、10 ng/L、5 ng/L、2.5 ng/L、1 ng/L、0.5 ng/L系列標準溶液。

1.3.2 TCA-D5內(nèi)標工作液配制

準確稱取TCA-D5標品10mg，用四無乙醇定容至100mL容量瓶，質(zhì)量濃度為100 mg/L，作為TCA-D5內(nèi)標儲備液。用12%乙醇溶液逐級稀釋至質(zhì)量濃度為1 000 ng/L，作為TCA-D5內(nèi)標工作液。

1.3.3 樣品處理

在室溫下將20個軟木塞置于1 L廣口瓶內(nèi)，倒入乙醇溶液直至充滿廣口瓶，浸泡24 h后取出浸提液，作為樣品溶液。稱取1.5 g氯化鈉于20 mL頂空樣品瓶中，加入5 mL樣品溶液和0.1 mL的TCA-D5內(nèi)標工作液，壓蓋，備用。

1.3.4 儀器參數(shù)設(shè)置

固相微萃取：平衡溫度40 ℃，平衡時間5 min，攪拌速度250 r/min；萃取溫度40 ℃，萃取時間30 min；解吸溫度250 ℃，解吸時間5 min；萃取頭老化溫度260 ℃，老化時間1 min。

進樣口溫度：250℃。升溫程序：初始柱溫70℃，以10℃/min升溫至160 ℃；再以25 ℃/min升溫至250 ℃，保持3 min。進樣方式：不分流進樣，1 mL/min。載氣：高純氦氣（He）。色譜與質(zhì)譜接口溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲時間7 min。

1.3.5 數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)ISO 20752—2014的測定原理及檢測過程，并參考CNAS-GL006：2019[12]和JJF1059.1—2012[13]，待測物中TCA含量（ng/L）的計算公式如下：

式中：X為樣品中TCA的質(zhì)量濃度，ng/L；f為TCA的相對校正因子；A為樣品中TCA的峰面積；Ai為添加于樣品中內(nèi)標TCA-D5的峰面積；I為內(nèi)標物的質(zhì)量濃度（添加在樣品中），ng/L；Asi為標樣f值測定時內(nèi)標TCA-D5的峰面積；As為標樣f值測定時TCA的峰面積；c為標樣中TCA的質(zhì)量濃度，ng/L；csi為內(nèi)標物TCA-D5的濃度（添加在標樣中），ng/L。

1.3.6 不確定度來源分析

通過對檢測過程和數(shù)學(xué)模型的分析，影響木塞中TCA含量不確定度的因素有：（1）重復(fù)性測定引入的不確定度；（2）樣品加標回收率產(chǎn)生的不確定度；（3）標準系列配制引入的不確定度（包括：標準物質(zhì)和內(nèi)標物質(zhì)純度、標準物質(zhì)和內(nèi)標物質(zhì)稱量、標準物質(zhì)和內(nèi)標物質(zhì)稀釋、標準溶液系列配制）[15-17]；（4）標準曲線擬合引入的不確定度；（5）樣品制備引入的不確定度（包括：12%乙醇溶液配制、樣品取樣、添加內(nèi)標物）。木塞中TCA含量測定不確定度分量因果關(guān)系見圖1。

圖1 不確定度分量因果關(guān)系圖Fig.1 Causality diagram of uncertainty components

2 結(jié)果與分析

2.1 各分量不確定度的計算

2.1.1 重復(fù)性測定引入的不確定度

與測量結(jié)果直接相關(guān)的重復(fù)性測量過程，包括樣品的均勻性測量、設(shè)備的重復(fù)性以及樣品前處理過程的重復(fù)性，這一分量可由測量結(jié)果的重復(fù)性表示。在重復(fù)條件下對某一木塞浸提液進行8次平行試驗，測量數(shù)據(jù)見表1。

表1 重復(fù)性試驗測量結(jié)果Table 1 Determination results of repeated tests

2.1.2 樣品加標回收率引入的不確定度

在本底值為2.04 ng/L的樣品溶液中加入TCA標準溶液，加入量為2.00 ng/L，并重復(fù)測定6次，測得值及回收率如表2所示。

表2 樣品回收率測定結(jié)果Table 2 Determination results of recovery rates of samples

回收率平均值的標準不確定度u（r′）=0.559 3，其相對標準不確定度為ur（r′）=0.005 6。

2.1.3 標準溶液配制引入的相對不確定度

（1）標準物質(zhì)和內(nèi)標物質(zhì)純度引入的相對不確定度

TCA標準品的純度為99.5%，擴展不確定度為0.5%（k=2）；TCA-D5標準品的純度為98.8%，擴展不確定度為1.0%（k=2）。則由標品純度引入的相對不確定度[18-19]分別為：

（2）標準物質(zhì)和內(nèi)標物質(zhì)稱量引入的相對不確定度

配制TCA與TCA-D5標準儲備液時需稱量標品各0.01 g，要求使用的天平最小分度為0.01 mg。JJG 1036—2008《電子天平檢定規(guī)程》[20]規(guī)定，該準確級的天平在0.01～5.00 g稱量的最大允差為±0.05 mg，與天平檢定證書結(jié)果一致。屬均勻分布，所以相對不確定度分別為：

（3）標準物質(zhì)和內(nèi)標物質(zhì)稀釋引入的相對不確定度

標品：稱取TCA標品0.01 g，用四無乙醇定容至100 mL容量瓶，TCA標準儲備液質(zhì)量濃度為100mg/L；之后用12%乙醇溶液逐級稀釋至TCA質(zhì)量濃度為100ng/L（1mL→100 mL，1mL→100 mL，1 mL→100 mL）。

第一步所使用的100 mL容量瓶，經(jīng)校準符合A 級[21]，其允差為±0.10 mL，以三角分布計，由此引入的不確定度為=0.04，相對不確定度為：ur（d0）=實驗室溫度控制在（20±2）℃，乙醇的體積膨脹系數(shù)為7.5×10-4/℃，假設(shè)溫度變化呈均勻分布，k=，則由溫度引起體積變化的不確定度[22]為：u（t0）==0.09，相對不確定度為：ur（t0）=0.000 9。則TCA標品定容引入的相對不確定度為：ur（D0）=

第二步逐級稀釋引入的相對不確定度分量見表3。

表3 2,4,6-三氯苯甲醚標準儲備液逐級稀釋引入的不確定度Table 3 Uncertainty introduced by successive dilution of 2,4,6-trichloroanisole standard reserve solution

由表3可知，一級稀釋引入的相對不確定度為：

同理，二級稀釋引入的相對不確定度為：

三級稀釋引入的相對不確定度為：ur（D3）=0.002 9。

綜上，標準物質(zhì)TCA稀釋引入的相對不確定度ur（D）=

內(nèi)標：稱取TCA-D5標品0.01 g，用四無乙醇定容至100mL容量瓶，TCA標準儲備液質(zhì)量濃度為100 mg/L；之后用乙醇溶液逐級稀釋至TCA-D5質(zhì)量濃度為1 000 ng/L（2 mL→100 mL，2 mL→100 mL，2.5 mL→100 mL）。

由表4可知，TCA-D5標品定容引入的相對不確定度為：

表4 2,4,6-三氯苯甲醚內(nèi)標物質(zhì)逐級稀釋引入的不確定度Table 4 Uncertainty introduced by successive dilution of 2,4,6-trichloroanisole-D5 internal standard reserve solution

一級稀釋引入的相對不確定度為：

同理，二級稀釋引入的相對不確定度為：

三級稀釋引入的相對不確定度為：ur（D3內(nèi)）=0.008 2。

（4）標準溶液系列配制引入的相對不確定度

配制20 ng/L的標準溶液引入的相對不確定度為ur（p20）=同理ur（p10）=0.012 5，ur（p5）=0.014 8，ur（p2.5）=0.021 8，ur（p1）=0.016 7，ur（p0.5）=0.036 5。因此，標準溶液系列配制引入的相對不確定度為：ur（p）=

由于標準溶液配制完成后，需分別取5 mL標液、100 L內(nèi)標加入樣品瓶。則：

（a）標準溶液取樣引入的相對不確定度

用A級5 mL單標線吸量管移取標準溶液，最大容量允差為±0.015 mL，按均勻分布考慮，k=，由此引入的相對不確定度為ur（V）==0.001 7。實驗室溫度控制在（20±2）℃，12%乙醇溶液的體積膨脹系數(shù)為2.73×10-4/℃，假設(shè)溫度變化呈均勻分布，k=，則由溫度引起體積變化的相對不確定度為：ur（t）=。則標準溶液取樣引入的相對不確定度0.001 7。

（b）添加內(nèi)標物質(zhì)引入的相對不確定度

用100 μL移液器移取內(nèi)標液100 μL，最大容量允差為±2.0 μL，按均勻分布考慮，k=，由此引入的相對不確定度為ur（V）==0.011 5。實驗室溫度控制在（20±2）℃，12%乙醇溶液的體積膨脹系數(shù)為2.73×10-4/℃，假設(shè)溫度變化呈均勻分布，k=，則由溫度引起體積變化的相對不確定度為：ur（t）=。則添加內(nèi)標物質(zhì)引入的相對不確定度ur（V內(nèi)）=0.011 5。

綜上可知，標準系列溶液上儀器之前，因取標樣和添加內(nèi)標物引入的相對不確定度為：

所以，標準溶液系列配制這一步最終引入的相對不確定度為：

由2.1.3（1）～（4）可知，標準溶液系列配制全過程引入的相對不確定度為：ur（P總）=0.060 9。

2.1.4 標準曲線擬合引入的相對不確定度

以TCA與TCA-D5的峰面積比為縱坐標，TCA濃度為橫坐標，所得標準曲線回歸方程為：Y=0.066 3X；線性相關(guān)系數(shù)R2為：0.999 9。標準曲線產(chǎn)生的不確定度源于標準曲線殘差的標準偏差，殘差為測量值Y與標準曲線擬合值Y′之差的絕對值。TCA標準曲線殘差計算見表6。

表6 2,4,6-三氯苯甲醚標準曲線殘差計算Table 6 Calculation of residuals for 2,4,6-trichloroanisole standard curve

標準曲線擬合引入的標準不確定度根據(jù)公式u（f）=計算，b為斜率，p為樣品X0的測試次數(shù)（本實驗測定8次），Xˉ為標準溶液的平均質(zhì)量濃度。則u（f）=0.003 6（X0=2.04 ng/L），由標準曲線擬合引入的相對標準不確定度ur（f）=

2.1.5 樣品制備引入的相對不確定度

（1）12%乙醇溶液配制引入的相對不確定度

由于TCA的遷移量與乙醇濃度有關(guān)，因此應(yīng)考慮12%乙醇溶液配制引入的相對不確定度。用250 mL量筒移取乙醇240 mL，容量允差為±1.0 mL，按均勻分布考慮，k=由此引入的相對不確定度為ur（V）==0.002 4；實驗室溫度控制在（20±2）℃，乙醇的體積膨脹系數(shù)為7.5×10-4/℃，假設(shè)溫度變化呈均勻分布，k=，則由溫度引起體積變化的相對不確定度為：ur（t）=。因此，由量筒移取引入的相對不確定度ur（量筒）=0.002 6。

將乙醇定容至A級2000mL容量瓶，容量允差為±0.6mL，按均勻分布考慮，k=，由此引入的相對不確定度為=0.000 2；實驗室溫度控制在（20±2）℃，12%乙醇溶液的體積膨脹系數(shù)為2.73×10-4/℃，假設(shè)溫度變化呈均勻分布，k=，則由溫度引起體積變化的相對不確定度為：ur（t）=。因此，由定容引入的相對不確定度ur（定容）

12%乙醇溶液配制引入的相對不確定度ur（溶）=

（2）樣品取樣引入的相對不確定度

由2.1.3（4）（a）可知，樣品取樣引入的相對不確定度ur（樣）

（3）添加內(nèi)標物質(zhì)引入的相對不確定度

由2.1.3（4）（b）可知，添加內(nèi)標物質(zhì)引入的相對不確定度ur（內(nèi)）

綜上，樣品制備引入的相對不確定度ur（s）=0.011 9。

2.2 合成標準不確定度

TCA檢測過程相對不確定度分量見表7。

表7 2,4,6-三氯苯甲醚相對不確定度分量Table 7 Relative uncertainty subscale of 2,4,6-trichloroanisole

合成相對標準不確定度為

試樣中TCA含量的平均值X=2.04 ng/L，則標準不確定度

2.3 擴展不確定度的評定

根據(jù)CNAS-GL006：2019[12]，取置信區(qū)間P=95%，包含因子k=2；根據(jù)公式擴展不確定度U=uc（X）×2，則TCA的擴展不確定度為UTCA=0.26。最終檢測結(jié)果可表示為：TCA含量X=（2.04±0.26）ng/L，k=2。

3 結(jié)論

本文采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對木塞中TCA含量進行測定，并對該過程可能引入不確定度的因素進行深入考量、評定。結(jié)果表明，標準溶液系列配制過程引入的不確定度最大，其次是內(nèi)標物質(zhì)添加過程；而重復(fù)性測定、加標回收率、標品稀釋等過程引入的不確定度相對較小，標品稱量、樣品取樣、乙醇溶液配制等引入的不確定度可忽略不計。當木塞中TCA遷移量為2.04 ng/L時，其擴展不確定度為0.26 ng/L（k=2）。因此，實驗過程中可通過提高實驗人員的操作水平、定期校準玻璃儀器、嚴格控制操作環(huán)境溫度、定期核查氣質(zhì)聯(lián)用儀等來減小測量不確定度，從而提高檢測結(jié)果的準確度、可靠性。