李婷婷，陳 雪，2，3，程 濤，劉 斌，孫 喆，2，甄玉國，2，3，秦貴信，張學峰，2，王 濤，2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院 吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室 動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全省部共建教育部重點實驗室，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學 吉農(nóng)博瑞奶?？萍佳邪l(fā)中心，吉林 長春 130118；3.長春博瑞農(nóng)牧集團股份有限公司吉林省飼料工程技術(shù)研究中心，吉林 長春 130118；4.雙遼市職業(yè)中專，吉林 雙遼 136402）

釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）為半子囊菌綱（Hemiascomycetes）內(nèi)孢霉目（Endomycetales）酵母科（Saccharomycetaceae）酵母菌屬（Saccharomyces）[1]，是一種單細胞真核微生物[2]。釀酒酵母培養(yǎng)物營養(yǎng)成分豐富，富含脂肪、蛋白質(zhì)、維生素等；特別是蛋白質(zhì)構(gòu)成理想，富含亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸[3-5]。釀酒酵母菌具有安全[6]、繁殖周期快、代謝快等特點；其生產(chǎn)過程容易控制，易于大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)，來源廣，大量應用于釀造、醫(yī)藥、飼料工業(yè)等多個領(lǐng)域[7-9]。

碳源、氮源、無機鹽、維生素等是釀酒酵母培養(yǎng)體系的重要成分。釀酒酵母培養(yǎng)體系種類多，培養(yǎng)體系的不同成分、不同濃度對釀酒酵母的菌體生長影響差異大[10]。現(xiàn)常用釀酒酵母菌體系為酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptone dextrose，YPD）培養(yǎng)體系，該體系的碳源與氮源為葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉[6]。在工業(yè)生產(chǎn)中，這三種物質(zhì)需求量大，價格貴，阻礙釀酒酵母菌發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)。因此為了降低釀酒酵母菌工業(yè)化生產(chǎn)成本，同時提高其生物量，優(yōu)化釀酒酵母培養(yǎng)體系十分必要。本研究在酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上，對本實驗室分離的釀酒酵母菌的培養(yǎng)體系進行優(yōu)化，以期得出最適于工業(yè)生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)體系，降低釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)的成本，提高其生物量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BR-01：本實驗室分離及保藏。

1.1.2 試劑

淀粉糖、玉米漿（均為生化試劑）：長春大成實業(yè)集團有限公司；蛋白胨、酵母浸粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；維生素B1（vitamin B1，VB1）、維生素B2（vitamin B2，VB2）、維生素B3（vitamin B3，VB3）、維生素B8（vitamin B8，VB8）、維生素B6（vitamin B6，VB6）（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、尿素、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、硫酸鎂（MgSO4）（均為分析純）：北京化學試劑公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，120 ℃滅菌20 min[11]。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-2C型數(shù)字式酸度計：上海SANXIN公司；SW-CJ-IF型潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UVmini-1280紫外分光光度計：日本島津公司；HT-211B型培養(yǎng)搖床：上海赫田科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及發(fā)酵培養(yǎng)

將釀酒酵母菌種接入YPD液體培養(yǎng)體系中，以30 ℃、150 r/min 條件培養(yǎng)16 h，將釀酒酵母菌活化3次，備用。

將活化后釀酒酵母菌種，按照5%的接種量，接入各培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min條件下，培養(yǎng)16 h，采用紫外分光光度計在波長560 nm處測定OD560nm值，檢測菌體生物量，其計算公式如下：

生物量=（試驗培養(yǎng)體系OD560nm值-對應空白培養(yǎng)體系OD560nm值）×各試驗組稀釋倍數(shù)

1.3.2 生長曲線

活化好的種子液，按5%的接種量，接種于裝液量為100 mL/250 mL的YPD培養(yǎng)體系，以30 ℃、150 r/min條件進行培養(yǎng)，空白YPD培養(yǎng)體系進行OD560nm值校正。將菌液與YPD培養(yǎng)體系用蒸餾水稀釋相同倍數(shù)（確保OD560nm值在0.2～0.8范圍），在波長560 nm處測定所對應的吸光度值（OD560nm值），每隔2 h測定一次，培養(yǎng)26 h，以培養(yǎng)時間（h）為橫坐標，OD560nm值為縱坐標，繪制菌株生長曲線。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)體系優(yōu)化單因素試驗

各試驗組培養(yǎng)體系初始pH值為5.0，裝液量為40%，接種量5%，每組培養(yǎng)體系6個平行，一個空白體系不接入菌種，進行OD560nm值校正，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)16 h 后，波長560 nm處測定OD560nm值。

以YPD培養(yǎng)基為標準，測定OD560nm值。碳源選擇4 g/mL糖蜜、3 g/mL 淀粉糖替代YPD中的葡萄糖（2 g/mL）；氮源選擇尿素（0.1 g/100 mL）、硫酸銨（（NH4）2SO4）（0.22 g/100 mL）、玉米漿（2 g/100 mL）替代YPD中的蛋白胨（0.33 g/100 mL）；磷酸鹽選擇磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、磷酸二氫銨（NH4H2PO4），分別添加0.1 g/100 mL；硫酸鹽選擇硫酸鎂、硫酸銅（CuSO4）、硫酸亞鐵（FeSO4）、硫酸錳（MnSO4），分別添加0.1 g/100 mL；B族維生素選擇VB1、VB2、VB3、VB6、VB8，分別添加0.000 1 g/100 mL（由于B族維生素只是作為一種營養(yǎng)物質(zhì)，添加微量即可有正向效果，考慮工業(yè)化生產(chǎn)成本，故不作濃度梯度篩選）。篩選出改良釀酒酵母培養(yǎng)體系的最佳碳源、氮源、磷酸鹽、硫酸鹽、B族維生素，進一步篩選出最佳添加量。

1.3.4 響應面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)體系

（1）Plackett-Burman 試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗，篩選出的最適碳源、氮源、無機鹽、B族維生素（VB2、VB3、VB8）進行Plackett-Burman（PB）試驗。選用8因素、N=12的Plackett-Burman設(shè)計（其中四組為空白試驗組，作為誤差分析項），每個因素分別取高、低2 個水平，高水平是低水平1.5倍，以篩選影響釀酒酵母發(fā)酵活菌數(shù)的主要組分因素。PB試驗因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burma試驗設(shè)計因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

（2）最陡爬坡試驗

依據(jù)Plackett-Burman 試驗結(jié)果，以各個顯著影響因素效應的大小設(shè)定變化步長[12]；依據(jù)變化的梯度方向確定爬坡方向，快速逼近最佳值區(qū)域[13]；確定主要影響因素為淀粉糖、玉米漿、尿素，將此3個因素進行最陡爬坡試驗。

（3）Box-Behnken 試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken 試驗的中心組合試驗設(shè)計原理，每個顯著影響因素取3個水平，進行3因素3水平15個試驗組的響應面分析試驗，分析每個因素主效應與交互效應，繪制響應曲面，求出最佳值，獲得最佳釀酒酵母培養(yǎng)體系。利用Box-Behnken 試驗設(shè)計，對釀酒酵母菌培養(yǎng)體系進行3因素3水平響應面分析，優(yōu)化淀粉糖（A）、玉米漿（B）、尿素（C）的濃度，響應值為釀酒酵母菌生物量[12]。Box-Behnken試驗因素與水平見表2。

表2 Box-Benhnken試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken experiments design

1.3.5 統(tǒng)計與分析

試驗結(jié)果以“平均數(shù)±標準偏差”形式表示。利用SPSS 23.0軟件，進行單因素范疇方差分析（analysis of variance，ANOVA）檢驗，P≤0.05為差異顯著，P≤0.01為差異極顯著。應用Design Expert 8.0.6軟件，擬合試驗結(jié)果，對擬合方程做顯著性檢驗及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母菌生長曲線的繪制

所測得的釀酒酵母菌生長曲線見圖1。由圖1可知，在0～6 h，釀酒酵母菌濃度上升緩慢，屬于適應新環(huán)境的階段，為延滯期；在6～14 h，釀酒酵母菌濃度迅速升高，為快速生長期；14 h后隨著時間增長，吸光度值呈現(xiàn)微增長趨勢，培養(yǎng)體系養(yǎng)分逐漸減少，缺乏釀酒酵母菌生長所需養(yǎng)分，菌體逐漸死亡，由于無法分離死亡菌體與活菌體，導致無法在生長曲線上看到衰退期，所以在14～26 h的前段為穩(wěn)定期，后段為衰退期。在同樣培養(yǎng)條件下制備釀酒酵母菌種子液，16 h 左右即可滿足試驗要求。

圖1 釀酒酵母菌BR-01生長曲線Fig.1 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae BR-01

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)體系優(yōu)化單因素試驗

不同碳源、氮源、無機鹽、B族維生素對釀酒酵母生物量的影響結(jié)果分別見表3和表4。由表3可知，淀粉糖做碳源時，釀酒酵母菌生物量最高，當其添加量為18 g/100 mL時，釀酒酵母菌生物量顯著高于其他各組，確定最佳添加量為18 g/100 mL。玉米漿組與尿素組的釀酒酵母菌生物量顯著高于其他氮源組，由于玉米漿屬于有機氮源，為持續(xù)利用氮源；尿素屬于無機氮源，為快速利用氮源，考慮應用有機氮源和無機氮源進行復配，找出最佳氮源配方。當培養(yǎng)體系氮源復配比例在玉米漿4 g/100 mL＋尿素0.1 g/100 mL時，釀酒酵母菌生物量顯著高于其他各組，所以氮源的最佳復配比例為玉米漿4 g/100 mL＋尿素0.1 g/100 mL。由表4可知，K2HPO4組釀酒酵母菌生物量顯著高于其他各磷酸鹽組，且其最適添加量為0.1 g/100 mL；MgSO4組釀酒酵母菌生物量顯著高于其他各硫酸鹽組，且最適添加量為0.05 g/100 mL。選擇VB2、VB3、VB8作為最佳B族維生素源，且添加量為0.000 1 g/100 mL。

表3 不同碳源、氮源對釀酒酵母菌生物量的影響Table 3 Effect of different carbon sources and nitrogen sources on the cell biomass of Saccharomyces cerevisiae

表4 不同無機鹽、B族維生素對釀酒酵母菌生物量的影響Table 4 Effect of different inorganic salt and vitamin B group on the cell biomass of Saccharomyces cerevisiae

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)體系優(yōu)化Plackett-Burman試驗

根據(jù)單因素試驗篩選結(jié)果，所得最佳釀酒酵母菌培養(yǎng)體系為：淀粉糖18 g/100 mL、玉米漿4 g/100 mL、尿素0.1 g/100 mL、K2HPO40.1 g/100 mL、MgSO40.05 g/100 mL、VB20.0001g/100mL、VB30.0001g/100mL、VB80.0001g/100mL。Plackett-Burman 試驗選用8因素（淀粉糖、玉米漿、尿素、K2HPO4、MgSO4、VB2、VB3、VB8），N=12次的試驗表格，各因子取高低2個水平。為估計試驗誤差，另設(shè)3個虛擬變量，響應值為釀酒酵母菌生物量，影響因子及編碼見表5。利用Design Expert 8.0.6 軟件分析試驗結(jié)果，比較各因素對釀酒酵母菌生物量的影響，篩選主要影響因素[14-15]。

表5 PB試驗設(shè)計結(jié)果Table 5 Results of Plackett-Burman experimental design

表6 PB試驗結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

PB試驗各影響因素主效應分析結(jié)果見表6。由表6可知，此模型P=0.002 7＜0.05，說明回歸方程顯著；該模型決定系數(shù)R2=99.44%，校正決定系數(shù)R2adj=97.95%，證明該模型數(shù)據(jù)擬合度較好，能對Plackett-Burman試驗進行模擬和解釋。釀酒酵母菌培養(yǎng)過程中，在α=0.05顯著水平上，淀粉糖、玉米漿、尿素對釀酒酵母菌生物量影響顯著（P＜0.05），淀粉糖和玉米漿為正效應，尿素為負效應；K2HPO4、MgSO4、VB2、VB3、VB8影響不顯著（P＞0.05）。因此選擇淀粉糖、玉米漿、尿素3個因素做主要因素，根據(jù)這3個因素的響應值選擇步長和方向，進行最陡爬坡試驗。

2.4 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果確定的的3個主要顯著因素進行最陡爬坡試驗，以獲取釀酒酵母菌最大生物量區(qū)域，根據(jù)各因素的變化方向及步長，設(shè)置5個試驗梯度，試驗設(shè)計及結(jié)果見表7。由表7可知，由于淀粉糖（A）、玉米漿（B）、尿素（C）三個主要顯著因素濃度不同變化，釀酒酵母菌生物量先升高后降低，第三組培養(yǎng)體系的釀酒酵母菌生物量達到最高值，故采用淀粉糖30 g/100 mL、玉米漿6 g/100 mL、尿素0.1 g/100 mL為中心點進行響應面試驗。

表7 最陡爬坡試驗結(jié)果Table 7 Results of the steepest accent experiments

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)體系優(yōu)化響應面試驗設(shè)計與結(jié)果

利用Box-Behnken 的旋轉(zhuǎn)中心組合試驗設(shè)計，對釀酒酵母菌培養(yǎng)體系進行3因素3水平響應面分析，優(yōu)化淀粉糖、玉米漿、尿素的濃度，響應值為釀酒酵母菌生物量[16]。各響應面試驗設(shè)計與結(jié)果見表8。

表8 Ben-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果Table 8 Results of Ben-Behnken experiments design

根據(jù)Box-Behnken 的試驗結(jié)果，應用Design Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行分析擬合[17]，得到淀粉糖、玉米漿、尿素3個因素對釀酒酵母菌生物量（Y）影響的回歸方程：Y=+60.91-1.80A+0.37B-0.38C-0.63AB+0.31AC+0.75BC-5.90A2-2.01B2-1.82C2。對回歸方程進行方差分析檢驗，結(jié)果見表9。由表9可知，模型P值為0.000 2，回歸項極顯著（P＜0.01），說明本模型有效；失擬項P值為0.751 5，失擬項不顯著（P＞0.05），說明該模型自變量與因變量之間函數(shù)關(guān)系極顯著，幾乎不存在失擬現(xiàn)象[18]；本模型的決定系數(shù)R2為98.96%，調(diào)整決定系數(shù)R2adj為97.08%，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為1.09%，說明此模型顯著，擬合度好[19]，可以用于釀酒酵母培養(yǎng)體系優(yōu)化與生物量預測。根據(jù)各因素P值大小，一次項A對釀酒酵母菌生物量影響極顯著（P＜0.01），二次項A2、B2、C2對釀酒酵母菌生物量影響極顯著（P＜0.01）。依據(jù)F值，將3個因素對釀酒酵母菌生物量影響大小進行排序，影響順序為淀粉糖＞尿素＞玉米漿。

表9 回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis of regression model

淀粉糖、玉米漿、尿素的交互效應三維分析響應面及等高線見圖2。

圖2 各因素交互作用對釀酒酵母生物量影響的響應面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the biomass of Saccharomyces cerevisiae

響應面坡面越陡峭，說明在固定一個因素不變時，其余兩個因素的交互作用對釀酒酵母菌生物量影響大；響應面坡面越平滑，說明對釀酒酵母菌生物量影響越小。由圖2可知，淀粉糖、玉米漿、尿素三個因素之間互有交互作用，應用Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化模塊，對響應值（釀酒酵母菌生物量）求極值，分析得到A=-0.16、B=0.1、C=-0.1，對應淀粉糖、玉米漿、尿素的添加量分別為28.8 g/100 mL、6.1 g/100 mL、0.097 5 g/100 mL。此模型預測的釀酒酵母菌生物量理論值為61.10。

2.6 響應面驗證試驗

為了驗證該模型預測的可靠性與準確性，進行驗證試驗。通過單因素試驗與響應面試驗，得到釀酒酵母菌最優(yōu)培養(yǎng)體系為：淀粉糖28.8 g/100 mL、玉米漿6.1 g/100 mL、尿素0.0975 g/100 mL、K2HPO40.1 g/100 mL、MgSO40.05 g/100 mL、VB20.0001g/100mL、VB30.0001g/100mL、VB80.0001g/100mL。將優(yōu)化后的培養(yǎng)體系與優(yōu)化前YPD培養(yǎng)體系進行對比分析（裝液量100 mL/250 mL、5%接種量、30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)16 h），每組6 個平行。結(jié)果表明，釀酒酵母菌優(yōu)化后的培養(yǎng)體系平均生物量實際值為60.60，與理論值（61.10）相對誤差為0.82%，試驗結(jié)果表明，應用響應面回歸方程擬合得出的理論值與實際值偏差較小，說明模型有效，具有一定實踐指導意義，可以較好預測釀酒酵母菌生物量[20]。優(yōu)化后的釀酒酵母生物量是優(yōu)化前的5.27倍。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗及響應面試驗優(yōu)化后得到的最優(yōu)釀酒酵母培養(yǎng)體系為：淀粉糖28.8 g/100 mL、玉米漿6.1 g/100 mL、尿素0.0975 g/100 mL、K2HPO40.1 g/100 mL、MgSO40.05 g/100 mL、VB20.000 1 g/100 mL、VB30.000 1 g/100 mL、VB80.000 1 g/100 mL。在此培養(yǎng)體系下，釀酒酵母生物量為60.60，是YPD培養(yǎng)體系的5.27 倍。優(yōu)化后的釀酒酵母培養(yǎng)體系以淀粉糖為碳源，以玉米漿和尿素為氮源。與YPD培養(yǎng)體系相比，優(yōu)化后的培養(yǎng)體系顯著提高釀酒酵母菌生物量，降低釀酒酵母培養(yǎng)體系成本，為釀酒酵母菌工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。