鄧星星，張 瑛，梁 莉，劉 煒，哈力比亞提·玉山，江 英

（1.新疆塔城地區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆塔城 834700；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000）

庫(kù)爾勒香梨（Pyrus communisL.）為薔薇科梨，屬植物白梨的果實(shí)，是新疆原產(chǎn)優(yōu)質(zhì)特色品種[1-2]。其果實(shí)肉質(zhì)細(xì)膩、味甜多汁、香味濃郁，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分。庫(kù)爾勒香梨果酒風(fēng)味口感獨(dú)特，具有良好的保健功能，越來越受消費(fèi)者喜愛。雖然香梨酒的釀造工藝已相對(duì)成熟，但仍存在一些技術(shù)問題亟需解決，例如果汁的氧化和褐變，香氣成分丟失和有機(jī)酸含量過高等。當(dāng)前，在香梨酒的釀造過程中，通常會(huì)加入二氧化硫來防止果酒的氧化變質(zhì)和抑制雜菌生長(zhǎng)，但二氧化硫與酒中化合物反應(yīng)生成的有毒物質(zhì)，不利于人體健康[3-4]。因此，需要尋找一種更合適的防腐劑或添加劑用于降低甚至替代二氧化硫的使用。

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的活性三肽，它天然存在于大多數(shù)真核生物和許多原核生物中[5]。GSH具有巰基等多種官能團(tuán)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的生理活性，具有抗氧化、解毒、清除自由基、抗輻射和維護(hù)蛋白質(zhì)及免疫系統(tǒng)正常功能的作用[6]。世界葡萄與葡萄酒組織（International Organization of Vine and Wine，OIV）規(guī)定GSH為葡萄汁和葡萄酒的安全添加物，這為生產(chǎn)健康安全的高品質(zhì)果酒提供了科學(xué)的指導(dǎo)[7]。研究證實(shí)，GSH可以作為防腐劑用于葡萄酒和蘋果酒中[8]。然而，GSH對(duì)果酒品質(zhì)影響的研究較少，XU J N等[9]研究認(rèn)為，蘋果酒發(fā)酵過程中加入20 mg/L GSH可提升果酒品質(zhì)，這是因?yàn)镚SH的添加可提升總酚含量，并改變香氣特征。因此，本研究以新疆庫(kù)爾勒香梨為原料，制備香梨酒，通過分析不同GSH添加量（0、10 mg/L、20 mg/L和30 mg/L）在酒精發(fā)酵過程中對(duì)香梨酒的基本理化成分、酚類物質(zhì)、揮發(fā)性香氣和感官特性的影響，探討GSH在香梨酒發(fā)酵過程中的作用，以期為果酒釀造工藝改進(jìn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

庫(kù)爾勒香梨：購(gòu)買于新疆塔城市金盛超市；果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：市售；檸檬酸、碳酸氫鈉、異抗壞血酸、無水乙醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；果膠酶（10 000 U）：山東濟(jì)寧和美生物工程有限公司；沒食子酸（純度≥98.0%）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；PHS-3C pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；QP2010plus型氣質(zhì)聯(lián)用（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）儀：日本島津公司；WAY-2S數(shù)字阿貝折射儀：廣州市愛宕科學(xué)儀器有限公司；D-55122電位滴定儀：德國(guó)Mainz公司；ZXSD-1160生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；HR1871榨汁機(jī)：飛利浦（中國(guó)）投資有限公司；BL-206-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科技儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 香梨酒的釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：選擇新鮮成熟的香梨，清水洗凈后去核、切塊，用榨汁機(jī)將香梨打漿，添加0.2%的異抗壞血酸護(hù)色，護(hù)色后的梨汁加入3‰果膠酶混勻，38 ℃果膠酶酶解10 h后，85 ℃進(jìn)行滅酶處理10 min。用8層紗布過濾，得到澄清梨汁備用，分成4組，分別添加0、10 mg/L、20 mg/L和30 mg/L的GSH，共4種香梨酒樣，以不添加GSH 的香梨酒空白作為對(duì)照組（CK）；添加10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L GSH的香梨酒分別編號(hào)為GSH-10、GSH-20、GSH-30。添加蔗糖將香梨汁糖度調(diào)節(jié)至20°Bx，用0.5 mol/L 的碳酸氫鈉溶液將香梨汁pH值調(diào)至為5.5，取2 g果酒專用酵母添加到30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的蔗糖溶液中，攪拌均勻，在30 ℃條件下活化約30min，至糖水中出現(xiàn)大量的小氣泡為止。取0.06 g/mL活化酵母液5 mL接種至香梨汁中，使用紗布封閉瓶口，置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵，定期測(cè)定酒精度，待酒精度不再升高，終止發(fā)酵。

1.3.2 總酚含量的測(cè)定

總酚含量的測(cè)定采用福林酚比色法。取稀釋20倍的香梨酒0.5 mL加入至試管中，并在試管中按順序加入0.5 mL蒸餾水、0.5 mL福林酚試劑和1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%碳酸鈉溶液，在20 ℃條件下避光放置120 min后于波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定其吸光度值。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.031 4x+0.022 7（R2=0.993 6）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總酚含量（以沒食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）表示）。

1.3.3 顏色指數(shù)測(cè)定

顏色指數(shù)的測(cè)定參考WEBBER V等[10]的方法，取4 mL香梨酒樣，加入8 mL無水乙醇，室溫靜置10 min后，用離心機(jī)于4 000 r/min下離心15 min，吸取上清液在波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定吸光度值（A420nm），以吸光度值表示其顏色指數(shù)。吸光度值越大，表明其顏色越深。

1.3.4 揮發(fā)性組分的檢測(cè)

揮發(fā)性組分的測(cè)定采用氣質(zhì)聯(lián)用法。將1 mL香梨酒樣品置于20 mL頂空瓶?jī)?nèi)，調(diào)節(jié)溫度為50 ℃，平衡40 min，將萃取頭插入頂空瓶中萃取30 min后拔出萃取頭并置于250 ℃的進(jìn)樣口中解吸2 min。

氣相色譜條件：DB-WAX石英毛細(xì)管柱（30m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：柱溫箱初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至120 ℃，再以10 ℃/min上升到200 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣（He），流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，傳輸線溫度250 ℃，采用全掃描模式采集信號(hào)，掃描范圍35～500 m/z。

1.3.5 香梨酒感官評(píng)價(jià)

香梨酒感官評(píng)價(jià)參照國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]和GB/T 10220—2012《感官分析方法學(xué)總論》[12]，感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。由10名專業(yè)感官評(píng)價(jià)員組成品評(píng)小組對(duì)樣品的外觀、香氣、口感和典型性4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，以優(yōu)、良、合格、不合格為評(píng)價(jià)等級(jí)，采用模糊數(shù)學(xué)法對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析，滿分100分。

表1 香梨酒感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of fragrant pear wine

續(xù)表

評(píng)價(jià)因素集U={U1，U2，U3，U4}，其中U1，U2，U3，U4分別代表評(píng)價(jià)指標(biāo)為外觀、香氣、口感、典型性。

評(píng)價(jià)評(píng)語集V={V1，V2，V3，V4}，其中V1，V2，V3，V4分別代表評(píng)價(jià)的評(píng)分為優(yōu)、良、合格、不合格。

模糊關(guān)系綜合評(píng)判集Y=X×R，其中X為權(quán)重集，經(jīng)專家評(píng)議X={X1，X2，X3，X4}={0.2，0.3，0.3，0.2}，R為模糊矩陣，且R=U×V。將評(píng)價(jià)評(píng)語集中的優(yōu)、良、合格和不合格四個(gè)等級(jí)分別賦值為100分、80分、70分和60分，則綜合評(píng)判集Y與對(duì)應(yīng)評(píng)語等級(jí)分?jǐn)?shù)的乘積之和為該產(chǎn)品的最終得分。

1.3.6 基本理化指標(biāo)的測(cè)定

可溶性固形物（soluble solids，TSS）采用手持糖度儀；pH值采用pH計(jì)；還原糖、總酸和酒精含量參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Origin 9.0和SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。除特殊說明外，每個(gè)樣品測(cè)定均重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。顯著性分析使用Duncan檢驗(yàn)（P＜0.05為顯著差異），顯著性差異結(jié)果采用標(biāo)記字母法表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同谷胱甘肽添加量對(duì)香梨酒基本理化指標(biāo)的影響

表2 不同谷胱甘肽添加量香梨酒的基本理化指標(biāo)Table 2 Basic physicochemical indexes of pear wine with different glutathion addition

不同谷胱甘肽添加量香梨酒的基本理化指標(biāo)結(jié)果見表2。由表2可知，酒精度在10.14%vol～10.24%vol之間，且無顯著性差異（P＞0.05），這可能是GSH 并不參與酒精發(fā)酵過程中乙醇的代謝[6]，香梨酒的其他理化指標(biāo)（可溶性固形物、總糖含量、pH值和滴定酸）基本不受GSH添加量的影響，這可能是因?yàn)樘砑恿?0%以內(nèi)的GSH對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)代謝無顯著影響[10]。梁曉芳等[13]研究了谷胱甘肽的添加對(duì)干白葡萄酒的基本理化指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示在35 d加速氧化條件下，葡萄酒中添加0.05 mg/L的GSH可保護(hù)果酒的可溶性固形物和還原糖含量。在工業(yè)應(yīng)用中，GSH的添加不會(huì)引起果酒基本理化指標(biāo)的改變，GSH具有還原性可以保護(hù)多酚物質(zhì)滿足生產(chǎn)的要求。

2.2 不同谷胱甘肽添加量對(duì)香梨酒總酚含量和顏色指數(shù)的影響

不同谷胱甘肽添加量香梨酒總酚含量和顏色指數(shù)見圖1。由圖1可知，香梨酒總酚含量隨GSH添加量（0～20mg/L）的增大而升高，當(dāng)GSH添加量＞20 mg/L之后趨于平穩(wěn)。香梨酒總酚含量的升高是因?yàn)橄憷婢漆勗爝^程中酚類化合物會(huì)發(fā)生酶促氧化和化學(xué)氧化（非酶氧化）兩種氧化形式。在添加GSH之前的榨汁過程中，果汁中的酚類化合物就已經(jīng)多酚氧化酶催化發(fā)生酶促氧化反應(yīng)，所以GSH的添加幾乎不能抑制多酚的氧化。但GSH具有還原性，可以和果酒中的氧化物結(jié)合，避免黃烷醇類、黃酮醇類和羥基肉桂酸類等多酚物質(zhì)發(fā)生化學(xué)氧化[13]。當(dāng)GSH添加量較少時(shí)，添加的GSH全部發(fā)生反應(yīng)，此時(shí)GSH的含量不足以平衡氧化物；隨著添加量的增加，GSH出現(xiàn)過?，F(xiàn)象，在保證氧化物質(zhì)被消耗完后仍然剩余，因此總酚含量不發(fā)生顯著性變化。

圖1 不同谷胱甘肽添加量香梨酒的總酚含量和顏色指數(shù)Fig.1 Total phenolic contents and color indexes of fragrant pear wine with different glutathion addition

由圖1亦可知，當(dāng)GSH添加量＜20 mg/L之前，香梨酒顏色指數(shù)（A420nm值）從0.31降低至0.18?？赡苁且?yàn)镚SH阻止了果酒的非酶促褐變。酒中的酚類物質(zhì)可以被氧化為醌類化合物，由于鄰醌類物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，醌類物質(zhì)相互聚合或與蛋白質(zhì)、氨基酸、酚類等發(fā)生聚合生成深色聚合物，導(dǎo)致香梨酒的褐變。GSH能與醌類化合物發(fā)生聚合反應(yīng)，生成即不會(huì)被氧化也沒有顏色的產(chǎn)物，從而阻斷褐變過程，抑制果酒的褐變[13]。

2.3 不同谷胱甘肽添加量對(duì)香梨酒揮發(fā)性組分的影響

香梨酒發(fā)酵過程中，不同GSH添加量對(duì)果酒揮發(fā)性組分的影響結(jié)果見表3。

表3 不同谷胱甘肽添加量香梨酒的揮發(fā)性組分Table 3 Volatile compounds of pear wine with different glutathion addition

續(xù)表

由表3可知，隨著GSH添加量在0～30 mg/L范圍內(nèi)增加，果酒中異戊醇、異丁醇、正辛醇和苯乙醇的含量顯著增加（P＜0.05），分別增加了21.80%、24.88%、55.11%、30.25%。這可能是當(dāng)酵母細(xì)胞處于還原狀態(tài)時(shí)，還原型輔酶I可將醛類還原成醇類；處于氧化狀態(tài)時(shí)，氧化型輔酶I可將一些醇類物質(zhì)氧化為醛或揮發(fā)性羧酸。除此之外，Ehrlich反應(yīng)會(huì)將氨基酸被分解成特定的高級(jí)醇，從而增加醇類的相對(duì)含量[14]。

酯類香氣是香梨酒中最重要的香氣成分之一。果酒中的酯類物質(zhì)主要來源于酒精發(fā)酵過程中的酯化反應(yīng)和酵母的次級(jí)代謝，但也有一小部分來自于香梨汁。在本研究中，酯類香氣特別是乙酸乙酯、2-羥基丙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸異丁酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸辛酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、順-2-反-4-癸二烯酸乙酯等是主要的香氣物質(zhì)。己酸乙酯、苯乙酸乙酯和順2-反-4-癸二烯酸乙酯可賦予香梨酒水果香氣，能夠?qū)破焚|(zhì)起到積極作用[15]，它們的含量隨GSH添加量的增大而增加。賈娟等[3]認(rèn)為，香梨的特征風(fēng)味物質(zhì)為不飽和脂肪酸的酯類（如：順-2-反-4-癸二烯酸甲酯、乙酯等），GSH的添加能使得香梨酒保留濃郁的梨香。但是部分酯類在添加GSH后含量減少，可能是由于酒精發(fā)酵過程中還原狀態(tài)下的GSH抑制了醛類氧化成酸類，從而減少了醇和酸酯化反應(yīng)的機(jī)會(huì)[15-17]。

香梨酒中檢測(cè)出了辛酸、己酸、1-甲基-2-羥基苯甲酸3種酸類香氣。在低濃度時(shí)，揮發(fā)性酸類香氣會(huì)增加果酒的復(fù)雜性，而在超過它們的閾值時(shí)，它們會(huì)對(duì)果酒香氣產(chǎn)生負(fù)面影響。不同添加量GSH的香梨酒中的酸類含量均低于對(duì)照組。

萜烯類香氣主要來自于水果本身，可以增加果酒的特色風(fēng)味。萜烯類香氣的閾值較低，它們可以直接或通過協(xié)同作用賦予果酒花香氣味。萜品油烯、α-法尼烯、香茅醇、芳樟醇分別賦予果酒呈芳香的松木香氣、檸檬香味、微帶甜的柑橘風(fēng)味和玫瑰香氣。GSH的添加顯著增加了萜烯類物質(zhì)的含量（P＜0.05）。這可能是因?yàn)檩祁愇镔|(zhì)在發(fā)酵過程中容易被相應(yīng)的萜類的氧化物取代，而GSH在一定程度上可以抑制這種氧化反應(yīng)的發(fā)生[16-17]。

香梨酒中檢測(cè)出壬醛、糠醛、癸醛、苯甲醛4種醛類物質(zhì)，在低濃度下，苯甲醛會(huì)給果酒帶來令人愉悅的果香。GSH的添加顯著降低了醛類的含量（P＜0.05），這可能是因?yàn)镚SH的還原性有利于醛還原為醇，它的親核殘基還能夠與醛形成加合物。同樣，GSH的還原性抑制了醇類氧化成為酮類，可顯著降低酮類的含量[17-18]。

2.4 模糊數(shù)學(xué)法分析感官評(píng)價(jià)結(jié)果

根據(jù)表1將10位感官評(píng)價(jià)員的評(píng)分結(jié)果進(jìn)行匯總，建立4種香梨酒的模糊數(shù)學(xué)矩陣RCK、RGSH-10、RGSH-20、RGSH-30如下：

模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)法能綜合考慮多種評(píng)定因素，使得評(píng)定結(jié)果較為客觀[19-20]。根據(jù)模糊關(guān)系建立綜合評(píng)判集見表4。將評(píng)價(jià)評(píng)語集中的優(yōu)、良、合格和不合格四個(gè)等級(jí)分別賦值為100分、80分、70分和60分，綜合評(píng)判集與對(duì)應(yīng)評(píng)語等級(jí)的分?jǐn)?shù)乘積之和為該產(chǎn)品的最終得分。由此可計(jì)算得CK、GSH-10、GSH-20、GSH-30最終得分為84.6分、85.8分、88.1分、88.0分。因此，香梨酒感官評(píng)價(jià)結(jié)果為GSH-20＞GSH-30＞GSH-10＞CK。總的來說，添加20 mg/L的GSH香梨酒綜合感官評(píng)價(jià)得分最高為88.1分。

表4 香梨酒的感官綜合評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 Senory evaluation results of fragrant pear wines

3 結(jié)論

不同GSH添加量對(duì)香梨酒的基本理化指標(biāo)基本沒有影響，但總酚含量隨著GSH添加量的增大而增大（231.33～312.67 g/mL），GSH自身的抗氧化能力可以保護(hù)多酚被氧化，抑制果酒顏色指數(shù)上升（0.31～0.18）。GSH的增加可影響香梨酒揮發(fā)性香氣的組成，使得大多數(shù)的醇類、酚類和萜烯類香氣含量有所升高，酯類、醛酮類含量下降，香梨特征風(fēng)味增強(qiáng)，香氣更加柔和。數(shù)學(xué)模糊法感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，GSH添加量為20 mg/L時(shí)，香梨酒的感官評(píng)分最高為88.1分，酒體的外觀，口感，香氣更適合消費(fèi)者。在香梨酒發(fā)酵階段，適量GSH的添加可以減少二氧化硫的使用，改善果酒香氣成分和果酒品質(zhì)。但同時(shí)應(yīng)該考慮成本和過量添加對(duì)果酒品質(zhì)的不利影響，這為香梨果酒的工業(yè)生產(chǎn)提供一定的參考。