陳 怡，劉 洋，蔣立文，李 跑，廖盧艷

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

豆豉是一類深受消費者喜愛的發(fā)酵豆制品，其發(fā)酵過程中產(chǎn)生了活性肽、大豆低聚糖、大豆異黃酮、類黑精等一系列的活性物質(zhì)[1-4]，使豆豉具有抗癌、抗氧化及促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)等一系列的生理活性[5-8]，同時也賦予其獨特的風(fēng)味和藥用價值[9-11]。豆豉按照其優(yōu)勢發(fā)酵菌群的不同可分為毛霉型、曲霉型、根霉型、細(xì)菌型4種[12-13]，且均有各自的代表產(chǎn)品，如永川豆豉、瀏陽豆豉以及印尼丹貝和日本納豆等。納豆和丹貝均屬于單菌種發(fā)酵豆豉[14-15]，這類豆豉產(chǎn)品具有質(zhì)量穩(wěn)定、發(fā)酵過程容易控制等優(yōu)點，但在我國食用與生產(chǎn)較少。我國豆豉以曲霉型豆豉及毛霉型豆豉為主，均為自然發(fā)酵，發(fā)酵期間菌群復(fù)雜多樣、具有獨特風(fēng)味，但形成機(jī)理不明確，且產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定且難以調(diào)控。

高通量測序技術(shù)是現(xiàn)在較為先進(jìn)的技術(shù)之一，在發(fā)酵食品微生物組成分析中應(yīng)用廣泛。LIANG J J等[16]研究發(fā)現(xiàn)，泡菜的微生物群落處于優(yōu)勢地位由三個屬的成員組成：白串珠菌屬、乳酸菌屬和威塞拉屬。腐乳發(fā)酵中亦鑒定出50種細(xì)菌和99種真菌，涉及的細(xì)菌群落主要是不動桿菌屬，腸球菌和鏈球菌；而真菌（曲霉和紅曲霉），在發(fā)酵后階段約占整個菌群的95%[17]。MIN J K等[18]對共14種韓國豆豉樣品進(jìn)行菌群分析，得出關(guān)鍵的微生物有乳酸桿菌、腸球菌、芽孢桿菌。HE B等[19]則發(fā)現(xiàn)毛霉型豆豉在第一天時以曲霉屬（97.98%）和鏈球菌屬（1.11%）為主，而曲霉豆豉在發(fā)酵第一天時曲霉屬（67.34%）和念珠菌（28.23%）占主導(dǎo)地位；而隨著發(fā)酵時間的增加，曲霉型豆豉中曲霉菌的占比增加，而毛霉型豆豉中曲霉屬的占比下降。

瀏陽豆豉是典型的曲霉型淡豆豉，因其獨特的風(fēng)味廣受人們喜愛，是湘菜中不可或缺的一種調(diào)味料。其以泥豆或小黑豆為原料，制作方法為黑豆清洗、蒸煮、冷卻、自然制曲、洗霉、堆積發(fā)酵、發(fā)酵后熟、成品。不同于大多數(shù)曲霉豆豉，瀏陽豆豉發(fā)酵過程中不加入食鹽，屬于藥食兩用的淡豆豉。且由于發(fā)酵過程中主要的微生物來源于環(huán)境，因此不同生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品的微生物的組成和種類存在一定差異。為明確瀏陽豆豉中主要的優(yōu)勢微生物，本試驗通過內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析技術(shù)對4種不同品牌的瀏陽豆豉進(jìn)行分析，以闡明不同品牌的瀏陽豆豉的真菌群落情況，為瀏陽豆豉工業(yè)生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技有限公司。

瀏陽梁嘉豆豉（LJ）：湖南梁嘉食品有限公司；瀏陽太平橋豆豉（TPQ）：瀏陽市太平橋食品豆豉廠；瀏陽天馬山豆豉（TMS）：瀏陽市天馬山豆豉廠；瀏陽一品香豆豉（YPX）：湖南省瀏陽市一品香豆豉總廠。所有樣品均來源于同一個季節(jié)各品牌企業(yè)發(fā)酵成熟曲料，在整個制作場地的四個角和中心位置取樣后混合（一式三份）共1 kg左右，冷鏈運輸帶回實驗室，分別置于-80 ℃保存待測。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ凈化工作臺：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DHP120恒溫培養(yǎng)箱：上海實驗儀器廠有限公司；TP-620A型電子天平：湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；LGJ-10真空冷凍冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA提取

在同一品牌樣品的3份取樣袋中各取5 g豆豉混合，放入研缽中，倒入適當(dāng)?shù)囊旱?，立即研末成粉末狀，?.1～0.3 g作為待測樣本按照土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行基因組DNA抽提，再利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和純度，同時利用NanoDropOne檢測DNA的濃度和純度。

1.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及產(chǎn)物電泳檢測則以基因組DNA為模版，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶barcode的引物及PremixTaq（TaKaRa）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用GeneToolsAnalysisSoftware（Version4.03.05.0，SynGene）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行濃度對比后，按照等質(zhì)量原則計算個樣品所需體積，將各PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合。對真菌ITS2區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，選用引物fITS7（GTGARTCATCGAATCTTTG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGCPCR）。PCR反應(yīng)成分：Phusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5 μL，正向引物2.5 μL，反向引物2.5 μL，模版DNA 50 ng，最后向反應(yīng)液中加入ddH2O 至總體積25 μL；反應(yīng)條件：（循環(huán)次數(shù)）35×（95 ℃、30 s；退火溫度54 ℃、30 s；延伸溫度72 ℃、45 s）72 ℃、10 s，維持4 ℃直到結(jié)束。

1.3.3 Illumina Miseq測序和數(shù)據(jù)處理

使用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒回收PCR混合產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。后續(xù)建庫按照NEBNext?UltraTMDNA Library Preo Kit for Illumina?標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行建庫操作，完成后以高通量測序平臺Hiseq或Miseq對其進(jìn)行上機(jī)測序（廣東美格基因科技有限公司），測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識別（Base Calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列（Raw Reads），結(jié)果以FASTQ（簡稱為fq）文件格式儲存，其中包含測序序列（Reads）的序列信息以及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用PEAR軟件對雙端序列進(jìn)行拼接，嵌合體序列過濾采用Vsearch（v2.3.4，Vsearch）軟件。去除reads的引物序列（非高變區(qū)），將每一對paired-end reads拼接合并成一條更長的tag。對測序reads進(jìn)行窗口法質(zhì)量掃描，掃描窗口默認(rèn)為100 bp，當(dāng)窗口內(nèi)平均質(zhì)量值低于20時，將read從窗口起始到3'終止的部分截掉，去除截短后長度小于100 bp的序列，且去除截短后N（不確定模糊堿基）的含量在5%以上的序列以及嵌合體序列。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

物種注釋、豐富度等數(shù)據(jù)分析結(jié)果均采用GraphPad Prism 5 軟件統(tǒng)計及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中真菌群落共享和獨有的操作分類單元和韋恩圖分析

圖1 豆豉樣品韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Douchi samples

通過對真菌ITS1和ITS2區(qū)進(jìn)行測序，從12個樣本中得到1 234 222條序列，累計496個操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。由圖1可得，樣品種真菌OTUs總數(shù)分別為LJ（347）、TPQ（377）、YPX（361）、TMS（350），其中有146個OTUs是4種豆豉共有的。

2.2 豆豉中真菌多樣性分析

2.2.1 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用的度量標(biāo)準(zhǔn)包括反應(yīng)群落豐度的：Sobs、Chao、Chao1、Ace、Richness和用來反應(yīng)群落多樣性的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等[20]。據(jù)表1可得，YPX的Shannon指數(shù)最高（2.32）而樣品TMS則最低（1.24）。Chao1與Richness指數(shù)的變化趨勢一致，均顯示TPQ最高，分別為209.77、207.00，說明TPQ樣品的真菌豐度最大，其次是YPX，而TMS則是最低的樣品（分別為184.13、180.33）。

表1 真菌Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity indexes of fungi

基于Kruskal-Wallis秩和檢驗的真菌多組間差異結(jié)果見圖2。據(jù)圖2可知，TPQ的上邊緣與下邊緣距離最大，表明其平行組間差異較大，這可能與其在發(fā)酵期間受到外界雜菌侵染有關(guān)。YPX、TMS以及LJ上下邊緣差距較小，說明樣品中真菌分布較均勻。綜上所述，雖然TPQ真菌豐度最大，但平行樣品間存在較大差異，TMS的真菌豐度最低，真菌種類較為單一。為進(jìn)一步了解4種樣品豆豉中真菌情況，對其進(jìn)行物種群落進(jìn)行了進(jìn)一步分析，以明確各樣本中的真菌群落分布。

圖2 基于Kruskal-Wallis秩和檢驗的真菌多組間差異Fig.2 Differences among multiple groups of fungi based on Kruskal-Wallis rank sum test

2.2.2 豆豉中真菌的群落情況

由圖3（a）可知，真菌的門水平上的豐度情況，除未能鑒別的序列以外，4種豆豉樣本均是以子囊菌門（Ascomycota）、毛霉亞門（Mucoromycota）為主，其中TPQ、YPX及LJ子囊菌門相對豐度均超過80%。說明雖然發(fā)酵環(huán)境場地不同，非同種品牌的瀏陽豆豉在門水平上具有較高的相似性。此外，TMS的子囊門屬的相對豐度相對較低（29.9%），Unassigned（69.5%）是TMS樣品種的優(yōu)勢真菌，此樣品中大部分的菌未能鑒定，還有待進(jìn)一步研究。

由圖3（b）可知，除未能鑒別的序列以外，各豆豉樣品在真菌的屬水平上的分布差異較大：TMS優(yōu)勢菌屬主要包括曲霉屬（Aspergillus）；而TPQ中以曲霉屬（Aspergillus）和嗜熱菌屬（Thermomyces）為主要菌屬，其次是小囊菌屬（Microascus），其中嗜熱菌屬相對豐度最高（49.2%）；此外，YPX中的菌屬數(shù)量較其他樣品更豐富，主要有曲霉屬、小囊菌屬、青霉屬（Penicillium）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、單端孢屬（Trichothecium）；LJ中曲霉屬為相對豐度最高，為91.4%，其次是小囊菌屬。石聰?shù)萚21]對瀏陽豆豉中微生物進(jìn)行試驗后，發(fā)現(xiàn)在前期發(fā)酵過程中，屬水平大量出現(xiàn)了曲霉、青霉、根霉和酵母菌等，后續(xù)還出現(xiàn)了橫梗霉屬、嗜熱菌屬等，其中真菌部分與本實驗相符。此外，瀏陽豆豉發(fā)酵過程中真菌種類既有需要的曲霉、根霉等有益微生物，但也出現(xiàn)了部分青霉屬等可能影響產(chǎn)品質(zhì)量和安全的微生物，這些微生物對瀏陽豆豉風(fēng)味形成的貢獻(xiàn)還有待進(jìn)一步研究。

圖3 真菌群落在門水平（a）和屬水平（b）上的相對豐度比較Fig.3 Comparison of relative abundance of fungal communities at the phylum level (a) and genus level (b)

2.2.3 豆豉中真菌數(shù)量的聚類情況

熱圖可以通過板塊顏色的相似性及差異性來反應(yīng)多個樣本在各分類水平上群落的組成情況，從物種和樣品兩個層面進(jìn)行聚類，可以觀察到平行樣品之間會存在差別，不同種之間又存在相同點。據(jù)圖4的聚類結(jié)果可知，TPQ的平行組之間存在較大差異與圖1的結(jié)果相符合，另外YPX與LJ的真菌組成相似，而與其TMS、TPQ則相差較大。

圖4 真菌在屬水平上的聚類熱圖Fig.4 Cluster heatmap of fungus at genus level

橫坐標(biāo)反映的是不同菌屬在不同樣品中的存在情況，如嗜熱菌屬（Thermomyces）在TPQ樣品中含量最高，橫梗霉屬（Lichtheimia）則主要存在于TMS與LJ中，曲霉屬（Aspergillus）、單端孢屬（Trichothecium）和根霉屬（Rizopus）均在LJ中含量較高，木霉屬（Trichoderma）、單端孢屬（Tri chothecium）、青霉屬（Penicillium）、毛殼菌屬（Chaetomium）是YPX的特征菌屬。

2.2.4 主坐標(biāo)分析

主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法，通過一系列的特征值和特征向量進(jìn)行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值，將其表現(xiàn)在坐標(biāo)里。因此PCo1表示盡可能最大解釋數(shù)據(jù)變化的主坐標(biāo)成分，PCoA2則解釋余下的變化度中占比例最大的主坐標(biāo)成分，根據(jù)圖5可知，PCoA 1解釋了數(shù)據(jù)集中總方差的56.9%，而PCoA 2解釋了29.9%。圖5中不同顏色的點屬于不同樣本組，PCoA中橫縱坐標(biāo)的刻度線表示樣品之間的距離，除開LJ與YPX相靠較近，其他都集中在不同的區(qū)域，說明這4種瀏陽豆豉中LJ與YPX的菌群分布較為靠近，且與其它品牌豆豉的差異很大，這與圖4的熱圖聚類情況相符。由圖5還可知，LJ、YPX的三組平行之間差異較小，而TPQ與TMS組間差異則較大，這說明LJ與YPX樣品中真菌分布較為均勻，后兩者真菌組成情況則不統(tǒng)一，尤其是TPQ組間差異最大，此結(jié)果與圖1的箱型圖結(jié)果相符。

圖5 豆豉樣品的主坐標(biāo)分析Fig.5 PCoA analysis of Douchi samples

3 結(jié)論

本研究探索了不同品牌瀏陽豆豉的真菌組成情況，結(jié)果表明：TPQ樣品的真菌相對豐度最大，LJ則較低，YPX樣本中真菌的多樣性高，種類豐富；4種瀏陽豆豉均以子囊菌門、毛霉亞門為主要菌群門類，LJ和YPX中曲霉屬相對豐度最大，分別為91.4%、65.5%，TPQ則以小囊菌屬（49.1%）含量最高。TMS中除未能鑒別的，其次是曲霉屬（29.47%）的相對豐度最高。橫梗霉屬（Lichtheimia）主要存在TMS與LJ中，嗜熱菌屬（Thermomyces）在TPQ樣品中含量最高，曲霉屬（Aspergillus）、單端孢屬（Trichothecium）和根霉屬（Rizopus）均在LJ中含量較高，木霉屬（Trichoderma）、單端孢屬（Trichothecium）、青霉屬（Penicillium）、毛殼菌屬（Chaetomium）則在YPX含量最高；PCoA的結(jié)果反映出4種不同品牌的瀏陽豆豉YPX與LJ菌群相似以外，其余樣本相差較大。本研究全面解析了不同品牌瀏陽豆豉中的真菌組成，明確了其中的優(yōu)勢微生物，但瀏陽豆豉生產(chǎn)中微生物影響因素及其對瀏陽豆豉品質(zhì)的貢獻(xiàn)還有待進(jìn)一步研究。