王晨慧，李春揚(yáng)，張曉磊*，饒 靜，辛 鵬，李 楠，宋全厚

（1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京 100015）

山藥酒是以山藥為主要原料，經(jīng)酵母菌發(fā)酵而成的蒸餾酒、發(fā)酵酒，或經(jīng)蒸餾酒浸提后制成的山藥配制酒，因其可使山藥豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更加完全的溶入酒體，將藥物活性成分最大限度的保留，具有一定滋養(yǎng)強(qiáng)壯，助消化，斂虛汗，止瀉之保健功效，越來(lái)越受到消費(fèi)者喜愛(ài)[1-3]。甾醇又稱固醇，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種重要的天然活性物質(zhì)，可分為動(dòng)物性甾醇、植物性甾醇和菌類甾醇等三類[4-5]，動(dòng)物性甾醇以膽固醇為主，植物性甾醇主要為谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等，而麥角甾醇則屬于菌類甾醇，其中，植物甾醇可降低心血管、癌癥發(fā)病率，降膽固醇、促進(jìn)生長(zhǎng)等功效，也是各種植源性食品主要抗氧化活性成分之一[6]。

甾醇作為山藥的標(biāo)志性活性成分之一，目前其酒類產(chǎn)品的測(cè)定方法和含量水平，均未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[1]，因此急需建立山藥酒中甾醇含量的測(cè)定方法，并對(duì)其抗氧化功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。食品中甾醇類化合物的測(cè)定方法有分光光度計(jì)法[7]、液相色譜法[8-9]、氣相色譜法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11]等。分光光度計(jì)法和液相色譜法易受樣品中其他類化合物干擾，氣相色譜法和單級(jí)質(zhì)譜能得到準(zhǔn)確定量結(jié)果，但靈敏度不夠高。本研究采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜技術(shù)的高特異性和強(qiáng)抗干擾能力，大大提升方法靈敏度[12-14]，建立了4種常見(jiàn)植物甾醇和膽固醇同時(shí)測(cè)定的方法，并以DPPH自由基清除能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，為深入研究山藥酒的保健功效、提升產(chǎn)品品質(zhì)，提供技術(shù)手段和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥酒（1#山藥蒸餾酒、2#～5#發(fā)酵酒、6#～12#露酒）：市售。

5α-膽甾烷醇（內(nèi)標(biāo)，純度≥97%）、豆甾醇（純度98.09%）、β-谷甾醇（純度98.05%）、菜油甾醇（純度96.12%）、豆甾烷醇（純度≥98%）、正己烷（色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國(guó)Sigma公司；膽固醇（純度97.2%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；石油醚、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸鈉（均為分析純）：北京化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TQ8040氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography tandem mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀（配備AOC-20i+s自動(dòng)進(jìn)樣器）：日本島津公司；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；Rxi-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國(guó)Restek公司；T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

取一定體積酒樣于蒸發(fā)皿中，蒸發(fā)濃縮至10 mL轉(zhuǎn)移到皂化瓶中，依次加入內(nèi)標(biāo)物（5α-膽甾烷醇），2 mol/L氫氧化鈉-乙醇溶液50 mL，置于80 ℃恒溫水浴鍋中皂化60 min[15]，冷卻后，轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，分別用50 mL、50 mL、30 mL石油醚萃取3次，合并有機(jī)相，每次加入30 mL去離子水洗滌，直至洗至中性，再經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水后，于35 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入200 μL衍生劑（三氟乙酰胺∶三甲基氯硅烷=99∶1，V/V）60 ℃衍生30 min，正己烷定容至1 mL，上機(jī)分析。

1.3.2 GC-MS/MS條件

色譜條件[15]：Rxi-5 MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：柱溫200 ℃，以20 ℃/min升至300 ℃，以5 ℃/min升至320 ℃，保持4 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He）（純度≥99.999%），流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，能量70 eV；離子源溫度250 ℃；質(zhì)譜接口溫度280 ℃；溶劑延遲時(shí)間5 min；碰撞氣：高純氬氣（Ar）（純度≥99.999%）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取甾醇類標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg）至10 mL容量瓶中，以正己烷溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的甾醇類化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再逐級(jí)稀釋至一系列質(zhì)量濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一質(zhì)量濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入5 μL 5α-膽甾烷醇內(nèi)標(biāo)使用液，使其最終質(zhì)量濃度均為0.5 μg/L。

1.3.4 清除二苯代苦味?；杂苫―PPH·）能力測(cè)定

取不同體積的酒樣，加入1 000 μL DPPH·（濃度為100 μmol/L的乙醇溶液），將其充分混勻后暗處放置30 min后，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值，同時(shí)以2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）作陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算DPPH·清除率[16-17]。

式中：A0為DPPH溶液+同體積乙醇溶液的吸光度值；Ai為DPPH溶液+樣液的吸光度值；Aj無(wú)水乙醇+樣液的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用GC-MS/MS MRM模式，設(shè)定多個(gè)時(shí)間段和掃描通道實(shí)現(xiàn)對(duì)6種甾醇類化合物的同時(shí)測(cè)定。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件見(jiàn)表1。

表1 甾醇類化合物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件Table 1 Monitoring conditions for multiple reactions of sterols compounds

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）及典型樣品（b）的MRM譜圖Fig.1 MRM chromatogram of standard solution (a) and typical samples (b)

由表1可知，通過(guò)氣相色譜分離和單級(jí)質(zhì)譜全掃描方式確定各甾醇化合物的出峰順序及保留時(shí)間。以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）為掃描模式，根據(jù)目標(biāo)化合物的保留時(shí)間分為3個(gè)掃描窗口，使每個(gè)時(shí)間段的掃描離子對(duì)數(shù)量適中，調(diào)整離子對(duì)掃描時(shí)間，保證6種甾醇類化合物的同時(shí)檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的MRM譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，膽固醇和植物甾醇各組分在11 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好分離。

2.2 方法學(xué)考察

通過(guò)線性范圍及相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率，對(duì)方法進(jìn)行綜合評(píng)估，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 甾醇類化合物含量測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Methodological evaluation results of sterols contents determination

由表2可知，各甾醇類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍在103.5～57 500 μg/L，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.991，具有較好的線性關(guān)系；分別以信噪比為3和信噪比為10時(shí)的質(zhì)量濃度作為檢出限和定量限，其檢出限為0.230～14.48 μg/L，定量限為0.775～48.29 μg/L，高于氣相色譜法和單級(jí)氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的靈敏度；分別采用該方法對(duì)樣品平行測(cè)定6次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～1.2%；通過(guò)添加近等量的標(biāo)準(zhǔn)品，平行測(cè)定6次，加標(biāo)回收率為98.74%～101.3%。上述結(jié)果顯示該方法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可滿足山藥酒中甾醇化合物定量分析要求。

2.3 樣品分析

利用本研究所建立的方法對(duì)山藥酒進(jìn)行分析，其中包括1種山藥蒸餾酒，4種以山藥為原料的發(fā)酵酒和7種山藥露酒，化合物類別和含量詳見(jiàn)表3。

表3 樣品中甾醇類化合物含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of sterols contents in samples

結(jié)果顯示，不同種類山藥酒，其甾醇組成特點(diǎn)相似，均以β-谷甾醇或菜油甾醇含量最高；豆甾醇在山藥發(fā)酵酒中含量較高，而其飽和形式——豆甾烷醇在山藥發(fā)酵酒中含量較低；山藥酒中均存在一定量的膽固醇，含量為11.08～25.03 μg/L，遠(yuǎn)低于牛乳（15 mg/100 g）、瘦牛肉（58 mg/100 g）和鯽魚(yú)（130 mg/100 g）等食品中膽固醇含量[18]。以甾醇含量進(jìn)行比較，不同類山藥酒存在明顯差異：甾醇類化合物總量最高的是山藥蒸餾酒（1#），為1 240.39 μg/L，其中植物甾醇總量為1 218.27 μg/L，膽固醇為22.12 μg/L，發(fā)酵酒中甾醇類化合物含量普遍高于配制酒，發(fā)酵酒為160.72～1 114.81 μg/L，而配制酒僅為30.15～237.53 μg/L，這可能與酒種的不同工藝（發(fā)酵、浸泡）及山藥原料的使用量有關(guān)，甾醇含量測(cè)定結(jié)果可為進(jìn)一步對(duì)山藥酒中甾醇的功效評(píng)價(jià)提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

2.4 山藥酒DPPH·清除能力的測(cè)定

圖2 山藥酒DPPH自由基清除率測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determination results of DPPH free radical scavenging rate in yam alcoholic drinks

利用DPPH法[19-20]對(duì)1種山藥蒸餾酒，4種山藥發(fā)酵酒和7種山藥露酒進(jìn)行分析，如圖2所示。結(jié)果表明，山藥酒對(duì)DPPH自由基均有清除作用，且隨著取樣量增加，清除能力增強(qiáng)，具有良好的量效關(guān)系，清除率為0～93.12%；本實(shí)驗(yàn)用半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）值來(lái)反映樣液清除DPPH自由基的能力，IC50表示清除自由基50%時(shí)溶液的取樣量，其與清除能力呈負(fù)相關(guān)，IC50值越低，表明清除自由基能力越強(qiáng)，由圖2可知，基酒1#清除DPPH自由基活性能力最強(qiáng)，明顯高于其他樣品，其IC50值為213 μL，接近對(duì)照組BHT的IC50值（200 μL），而6#樣品取樣量為1 000 μL時(shí)，清除率僅為18.34%，抗氧化能力較低，12種山藥酒抗氧化能力排序?yàn)?#＞4#＞2#＞7#＞5#＞3#＞11#＞12#＞10#＞9#＞8#＞6#。

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測(cè)定山藥酒中4種常見(jiàn)植物甾醇和膽固醇的GC-MS/MS方法，該方法對(duì)甾醇類化合物進(jìn)行皂化提取，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定，對(duì)方法進(jìn)行評(píng)估，其相關(guān)系數(shù)R2≥0.991，檢出限為0.23～14.48 μg/L，定量限為0.775～48.29 μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.2%，加標(biāo)回收率為98.74%～101.3%，該方法靈敏度高，可滿足山藥酒中膽固醇和植物甾醇快速同時(shí)測(cè)定的分析要求。經(jīng)對(duì)部分市售山藥酒中甾醇化合物進(jìn)行分析和體外抗氧化評(píng)價(jià)，其甾醇類化合物組成相似，含量存在差異，含量范圍7.52～1 218.27 μg/L。以清除DPPH自由基為指標(biāo)對(duì)山藥酒體外抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，山藥酒均具有一定的抗氧化能力，其中山藥蒸餾酒和發(fā)酵酒的抗氧化活性高于山藥配制酒。